背景[1-3]
IRAK3抗体是一种可以特异性结合IRAK3的人工合成抗体，可以靶向结合人、小鼠、大鼠和猪样品中的IRAK3蛋白。IRAK3抗体与多种技术兼容，包括免疫印迹(WB)、免疫沉淀(IP)、免疫荧光(IF)、石蜡包埋切片免疫组化(IHCP)、流式细胞术(FCM)和酶联免疫吸附试验(ELISA)。IRAK3（⽩细胞介素-1受体相关激酶3）是炎症反应的细胞质稳态介质，可作为炎症的预后标志物。IRAK3与许多炎症疾病有关，包括败⾎症，并且在维持内毒素耐受以调节炎症稳态中起重要作⽤。IRAK3在巨噬细胞和胰腺腺泡细胞中表达，能够抑制NFκB的激活。
IRAK3抗体
IRAK3抗体使用步骤（Western Blot）：
1.样本制备
1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液），混匀。
2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。
3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
2.蛋白电泳
1）取出预制胶，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满tris-glycine电泳缓冲液。
2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。
3）混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
4）100℃或沸水浴加热3-5min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。
5）上样蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。
6）电泳后取出胶板，用刀在侧边硅胶处，沿着两片玻璃缝隙切开硅胶，即可打开玻璃板；取胶时。
3.转膜与封闭
1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。
2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。
3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。
4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。
5）转膜结束后，切断电源，取出膜。
6）将膜浸没在5mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。
7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5min。
8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脱液，再重复一次。
9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5min。
10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。
11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。
4.抗体孵育与检测
1）将膜和一抗（IRAK3抗体按照产品应用推荐稀释度）置于10mL一抗稀释缓冲液中在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动。
2）用5mL TBST洗涤三次，每次15min以去除残留的一抗(IRAK3抗体)。
3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。
4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。
5）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。
6）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液。将膜完全浸入发光工作液中，与发光工作液充分接触。室温孵育3min，准备立即压片曝光。但勿洗去发光液。
7）显影曝光。
应用[4][5]
IRAK3抗体可以用于鼻咽癌紫杉醇耐药细胞中FOLR1相互作用蛋白的验证
利用已建立的鼻咽癌的亲本细胞系及紫杉醇耐药细胞系,对前期研究筛选出的信号分子(Lyn、UBC、Ncaph2、IRAK3、Cu13)与FOLR1的相互作用进行验证,并初步探讨目的蛋白与FOLR1可能的相互作用通路。
方法：以免疫共沉淀及IRAK3抗体Western Blot方法验证体外培养的正常鼻咽上皮细胞NP69、三株鼻咽癌亲本细胞(CNE-1、HNE-2、5-8F)及紫杉醇耐药细胞(CNE-1/Taxol、HNE-2/Taxol、5-8F/Taxol)中FOLR1与Ly、UBC9、Ncaph2、IRAK3及Cu13是否存在相互作用。
IRAK3抗体结果：1.以FOLR1抗体对鼻咽癌紫杉醇耐药细胞系CNE-1/Taxol、HNE-2/Taxol以及5-8F/Taxol细胞总蛋白进行免疫共沉淀后,复合物中可以检测到Cul3、IRAK3以及Ncaph2的表达,但是无Lyn以及UBC9的表达,而阴性对照中5个抗体均无表达。2.以Cu13抗体、IRAK3抗体、Ncaph2抗体、Lyn以及UBC9抗体对鼻咽癌紫杉醇耐药细胞系CNE-1/Taxol、HNE-2/Taxol以及5-8F/Taxol细胞总蛋白进行免疫共沉淀后,Cul3、IRAK3以及Ncaph2沉淀的复合物中可以检测到FOLR1的表达,而Lyn及UBC9的复合物中未检测到FOLR1的表达,阴性对照NP69沉淀物中亦未检测到FOLR1的表达。结论：1.蛋白FOLR1与Cul3、IRAK3及Ncaph2在人鼻咽癌亲本细胞和鼻咽癌紫杉醇耐药细胞中均存在相互作用,而与Lyn及UBC9没有物理上的相互作用。2.Cu13、IRAK、Ncaph2、Lyn及UBC9在人永生化正常鼻咽上皮细胞、鼻咽癌亲本细胞及鼻咽癌紫杉醇耐药细胞中均有表达。
参考文献
[1]Inactivation of SMC2 shows a synergistic lethal response in MYCN-amplified neuroblastoma cells[J].Yuko Murakami-Tonami;;Satoshi Kishida;;Ichiro Takeuchi;;Yuki Katou;;John M Maris;;Hitoshi Ichikawa;;Yutaka Kondo;;Yoshitaka Sekido;;Katsuhiko Shirahige;;Hiroshi Murakami;;Kenji Kadomatsu.Cell Cycle,2014(7)
[2]Combined aberrant expression of microRNA-214 and UBC9 is an independent unfavorable prognostic factor for patients with gliomas[J].Shuai Wang;;Baohua Jiao;;Shaomei Geng;;Shucheng Ma;;Zhaohui Liang;;Shengkui Lu.Medical Oncology,2014(1)
[3]Ubc9 promotes invasion and metastasis of lung cancer cells[J].Hui Li;;Huiyan Niu;;Yang Peng;;Jiahe Wang;;Ping He.Oncology Reports,2013(4)
[4]Overexpression of the structural maintenance of chromosome 4 proteinis associated with tumor de-differentiation,advanced stage and vascular invasionof primary liver cancer[J].Bo Zhou;;Tao Yuan;;Menggang Liu;;Hongming Liu;;Jun Xie;;Yanbin Shen;;Ping Chen.Oncology Reports,2012(4)
[5]曾瑞芳.鼻咽癌紫杉醇耐药细胞中FOLR1相互作用蛋白的验证[D].中南大学,2014.