背景[1-3]
伪狂犬病毒野毒株(PRV-GE)核酸检测试剂盒(荧光PCR法)针对伪狂犬-病毒野毒株gE基因高度保守区基因序列设计特异性引物和荧光探针，用荧光PCR技术对伪狂犬-病毒野毒株的DNA进行体外扩增检测，用于科研实验中对可疑感染者的病原学具。
适用仪器：ABI7500、安捷伦MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf等系列荧光定量PCR检测仪。
样本类型：病死或扑杀的猪，取脑、淋巴结、脾脏、肺脏等组织；待检活猪，用棉拭子取鼻腔分泌物、唾液、乳汁等，置于50%甘油生理盐水中，或用注射器取血5mL。
伪狂犬病毒野毒株(PRV-GE)核酸检测试剂盒(荧光PCR法)
伪狂犬病毒野毒株(PRV-GE)核酸检测试剂盒(荧光PCR法)操作流程：
1.样本处理：组织样品：每份组织分别从3个不同的位置称取样品约1g，手术剪剪碎混匀后取0.5g于研磨器中研磨，加入1.5mL生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至1.5mL灭菌离心管中，8000rpm离心2min，取上清液100μL于1.5mL灭菌离心管中；分泌物棉拭子直接取100μL提取；血液取血清100μL提取。
2.试剂配制：加入预混反应液、酶及模板，离心混匀。
3.扩增检测：运行预设程序（如：95℃预变性10min，94℃15s→55℃30s，40循环），分析Ct值。
4.结果判读
结果分析条件设定
伪狂犬病毒野毒株(PRV-gE)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)设置Baseline和Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节Baseline的start值(一般可在3~15范围内调节)、stop值(一般可在5~20范围内调节)，以及Threshold的Value值(上下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。
阳性：检测通道Ct值≤40，且曲线有明显的指数增长曲线；
阴性：样本检测结果Ct值>40或无Ct值。
应用[4][5]
伪狂犬病毒野毒株(PRV-GE)核酸检测试剂盒(荧光PCR法)可以用于猪伪狂犬病病毒gB和gE基因Taqman两重实时荧光定量PCR方法的建立及初步应用
研究基于河南省PRV流行变异情况,针对自2012年以来的PRV流行毒株gE和gB基因的保守区域,设计出了各自的特异性引物和探针。基于设计出的引物和探针建立了猪伪狂犬病病毒gE和gB基因Taqman双重实时荧光定量PCR方法,并对建立的Taqman双重实时荧光定量PCR方法进行临床应用,以验证该方法的可行性。
主要的研究如下:1、PRV gE和gB基因重组质粒的构建:使用本实验室保存的扩增PRV gE和gB基因全长的引物对PRV基因组进行PCR扩增,把获得的目的片段胶回收纯化后克隆至pMD-18-T-Vector载体,而后转化进DH5α进行质粒提取,对所得到的重组质粒进行双酶切鉴定,并进行测序鉴定。从核酸琼脂糖凝胶电泳结果表明得到的条带与预期相符合;测序结果表明重组质粒的基因序列与选取的PRV gE和gB基因保守区域的相似性均为100%,说明成功构建PRV gE和gB基因的重组质粒。2、PRV gE、gB基因Taqman实时荧光定量PCR方法的建立:通过对GenBank中2012年以来的PRV流行毒株gE和gB基因序列进行对比分析,选择各自的保守区域设计了两对特异性引物和对应的探针。以构建的PRV gE和gB基因重组质粒为模板,基于Premix Ex Taq荧光定量试剂推荐的反应条件对反应条件进行优化,分别建立了PRV gE、gB基因Taqman实时荧光定量PCR方法。线性关系结果显示,两个方法的扩增效率都在90%-110%之间,线性相关系数均在0.99以上;特异性试验结果显示,两种方法都只能扩增含各自对应的基因组模板,而对其它病原不进行扩增;灵敏性试验结果显示,PRV gE基因Taqman实时荧光定量PCR方法针对含PRV gE基因最低检测浓度为2.74 copies/uL,比商品化的伪狂犬病毒野毒株(PRV-GE)核酸检测试剂盒(荧光PCR法)灵敏度高了大约10倍,PRV gB基因Taqman实时荧光定量PCR方法针对含PRV gB基因模板最低检测浓度为2.71 copies/uL,同样比本实验室建立的PRV gB基因普通PCR灵敏度高了大约10倍;稳定性试验结果显示,两种方法的批间和批内重复变异系数均低于1%,说明成功建立了PRV gE、gB基因Taqman实时荧光定量PCR方法。
参考文献
[1]Antiviral activity of porcine interferon delta 8 against pesudorabies virus in vitro[J].Zhang Teng;Liu Yunchao;Chen Yumei;Wang Jucai;Feng Hua;Wei Qiang;Zhao Shuangshuang;Yang Suzhen;Ma Hongfang;Liu Dongmin;Zhang Gaiping.International Journal of Biological Macromolecules.2021
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[3]Myths,facts and scope of spinal cord tolerance dose revision in Intensity modulated SIB treatment of locally advanced head and neck cancer:A dosimetrical and radiobiological demonstration[J].Patel G.;Mandal A.;Choudhary S.;Mishra R.;Shahi U.;Mishra H..Cancer/Radiothérapie.2020
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[5]张世军.猪伪狂犬病病毒gB和gE基因Taqman两重实时荧光定量PCR方法的建立及初步应用[D].河南农业大学,2021.