背景[1-3]
猪圆环病毒通用型(PCV-U)核酸试剂盒(荧光-PCR法)基于实时荧光定量PCR技术，通过特异性引物和探针扩增猪圆环病毒（PCV）的保守核酸序列，实现快速、灵敏的病毒检测。该试剂盒适用于猪血清、组织（如肺、淋巴结）、咽拭子等样本，可用于PCV感染的辅助诊断、流行病学调查及分子分型研究。
猪圆环病毒(Porcine Circovirus，PCV)有PCV-1和PCV-2两种型，其基因组为单链DNA，长度分别为1759nt和1768nt，其同源性低于80%，但基因组结构相似。PCV-1无致病性，广泛存在于猪体内。PCV-2对猪具有较强的易感性，感染猪可自鼻液、粪便等废物中排出病毒，经口腔、呼吸道途径感染不同年龄的猪。感染病毒后的病猪常见的症状是猪只渐进性消瘦或生长迟缓，这也是诊断所必需的临床依据，其他症状有厌食、精神沉郁、行动迟缓、皮肤苍白、被毛蓬乱、呼吸困难，咳嗽为特征的呼吸障碍，较少发现的症状为腹泻和中枢神经系统紊乱，一旦感染该病毒，发病率一般很低而病死率都很高，对养猪业带来较大的经济损失，因此猪圆环病毒通用的快速准确鉴定对该病的预防和检疫有着重要作用。
猪圆环病毒通用型(PCV-U)核酸试剂盒(荧光-PCR法)
猪圆环病毒通用型(PCV-U)核酸试剂盒(荧光-PCR法)特点：
1.即开即用，用户只需要提供病毒样品。
2.根据PCV-1和PCV-2共同的保守序列设计的专一性引物，与其他病毒无交叉反应。
3.灵敏度可以达到几百拷贝/反应。
4.可以同时测出PCV-1和PCV-2，但不能分型。
5.一管式荧光定量PCR检测，避免后续污染。
6.本试剂盒足够50次20μL反应体系的荧光定量PCR。
7.本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。
低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。
适用仪器
ABI、安捷伦、Roche、博日，天隆，宏石，鲲鹏等荧光定量PCR仪。
自备：无DNA/RNA酶的1.5mL离心管，0.2mL PCR反应管，滤芯吸头(规格:10μL，200μL，1000μL)，离心机，振荡混合器，各种规格的移液器。
操作步骤
1.样品处理（样本处理区）
1.1样本前处理
1.2DNA提取
2.试剂配制（试剂准备区）
3.加样（样本处理区）
4.PCR扩增（核酸扩增区）
5.结果分析判定
实验结果：
6.质控标准
阴性质控品：无明显扩增曲线或无Ct值显示；
阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且Ct值≤30；
以上条件应同时满足，否则实验视为无效。
7.产品性能指标
阴阳性参考品符合率：5份阳性参考品符合率为100％；10份阴性参考品符合率为100％。
最低检测限：检测灵敏度可达400copies/uL以下。
精密度：批内、批间精密度检测Ct值的变异系数（CV）均小于等于5%。
应用[4][5]
猪圆环病毒通用型(PCV-U)核酸试剂盒(荧光-PCR法)可以用于猪圆环病毒2型和3型双重荧光定量PCR方法的建立与应用
猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）和猪圆环病毒3型（Porcine circovirus type 3,PCV3）是整个生猪行业的巨大威胁。PCV2作为上世纪末发现的病毒,随着时间推进已经进化多达8种基因亚型,这为该病的防控带来了新的挑战与难度。PCV3作为新发现的圆环病毒给各个国家和地区带来了不可忽视的影响。近年来,两者的流行率逐渐上升且混合感染情况较为严重,基于此,本研究构建一种双重荧光定量PCR的方法来快速检测两种病毒。
1.PCV2和PCV3双重实时荧光定量PCR方法的建立基于PCV2和PCV3的ORF1基因设计两对扩增两种病毒保守片段的探针与引物,将目的片段插入PUC57中得到PCV2 ORF1和PCV3 ORF1两个质粒标准品。首先对两种引物进行普通PCR验证以确保仅能扩增出目的序列片段;之后基于猪圆环病毒通用型(PCV-U)核酸试剂盒(荧光-PCR法)针对两种引物与探针的体系及退火温度进行优化得到最佳的反应条件,选用1×10～5copies/μL质粒作为模板,将退火温度、探针与引物的剂量分别设置5个梯度,最终确定最佳退火温度为54℃,PCV2和PCV3的引物剂量为0.8μL和0.4μL,探针均为0.6μL。以优化后的体系与条件为基础,1×10～1～1×10～8copies/μL的两种标准品为模板建立该方法的标准曲线,结果表明二者的相关系数（R2）均大于0.99且E%在90%以上,最低检测限可达到10拷贝/反应。选取三个浓度梯度的质粒进行组内组间实验,猪圆环病毒通用型(PCV-U)核酸试剂盒(荧光-PCR法)结果表明相对标准偏差（RSD）均小于2%。特异性方面,该方法检测PRRSV、PRV、CSFV等均未出现扩增反应,说明具有较好的特异性。最后,使用国家标准PCV2、浙江省地方猪圆环病毒通用型(PCV-U)核酸试剂盒(荧光-PCR法)与本研究方法共同检测同一批样品,检出结果一致。
参考文献
[1]Development of a Gold Nanoparticle-Based ELISA for Detection of PCV2[J].Caroline Rodrigues Basso;Taís Fukuta Cruz;Larissa Baldo Vieira;Valber de Albuquerque Pedrosa;Fábio Sossai Possebon;João Pessoa Araujo Junior.Pathogens.2024
[2]The Prevalence and Genetic Diversity of Porcine Circoviruses(PCVs)during 2017–2023 in Guangdong Province,China[J].Wenke Lv;Lihua Cao;Lulu Yang;Nina Wang;Zhili Li;Shujian Huang;Feng Wen;Jinyue Guo.Animals.2023
[3]Development of a droplet digital PCR method for detection of porcine circovirus 4.[J].Liu Yangkun;Zhang Xinru;Han Xueying;Liu Jiaxing;Yao Lunguang.BMC veterinary research.2023
[4]Phylogenetic and Structural Analysis of Porcine Circovirus Type 2 from 2016 to 2021 in Jilin Province,China.[J].Chen Si;Li Xue;Zhang Liying;Zheng Jiawei;Yang Lin;Niu Guyu;Zhang Huimin;Ren Ying;Qian Jing;Sun Changjiang;Ren Linzhu.Microorganisms.2023
[5]石岱生.猪圆环病毒2型和3型双重荧光定量PCR方法的建立与应用[D].华中农业大学,2024.