简介
Westernblot所用DKC1抗体为兔源多克隆IgG，商品号R24118，分子量58kDa，工作浓度1∶2000。抗体于−20°C分装保存，避免反复冻融；使用前4°C解冻，与5%脱脂牛奶封闭液共同孵育可显著降低背景。该抗体在人VSMCs全蛋白裂解液中仅识别单一条带，无杂带干扰，条带位置与预染Marker58kDa完全对应。实验全程以GAPDH（37kDa，1∶5000）作为内参，批次间灰度变异系数<5%，保证定量可比性。此外，抗体说明书注明与人、鼠、大鼠DKC1蛋白均存在反应，但作者实测人源样本条带最强，鼠与大鼠仅微弱可见，提示其在人源血管组织研究中的优先适用性[1]。
DKC1抗体的性状
用途
为明确siRNA与过表达质粒的干预效率，作者将DKC1抗体用于Westernblot验证。VSMCs转染siDKC1或PEZ-M02-DKC136h后，RIPA裂解液提取总蛋白，20µg/孔上样。结果显示，siDKC1组DKC1条带灰度值降至siNC对照组的0.4倍（p<0.01），而PEZ-M02-DKC1组灰度值升至空载对照的1.8倍（p<0.01），与qRT-PCR的mRNA趋势一致。抗体的高灵敏度使内源低丰度DKC1也能被稳定检出，避免过度转染造成非生理高表达；同时，抗体对58kDa单一条带的特异性识别，确保后续功能实验建立在可靠敲减/过表达基础上，为增殖、迁移及信号通路研究提供严谨起点[1]。
在机制研究中，DKC1抗体被连续用于检测PI3K/AKT轴及其下游效应分子。Westernblot结果显示，过表达DKC1后，p-PI3K与p-AKT条带灰度分别较空载组增加2.1倍与1.9倍，总PI3K、总AKT亦同步上调；敲减DKC1则使磷酸化与总蛋白均下降约50%。同一抗体随后用于周期蛋白验证：DKC1过表达促进CyclinD1、D3表达，抑制P16；敲减则相反，与流式细胞术G1→S期转换结果一致。迁移实验中，抗体进一步揭示MMP3、MMP9表达变化：DKC1过表达使MMP3上调3倍、MMP9上调2.5倍，敲减则分别下降60%与55%。这些结果共同证实，DKC1通过增强PI3K/AKT信号驱动VSMCs增殖与迁移，抗体提供了关键分子证据[1]。
参考文献
[1] 林晓敏. DKC1调控PI3K/AKT通路促进血管平滑肌细胞增殖和迁移的机制研究[D]. 南方医科大学, 2022. DOI:10.27003/d.cnki.gojyu.2022.001787.