HLX1基因在成人组织中表达量低，且天然HLX1蛋白难以大量获取，因此需通过原核表达系统重组制备HLX1融合蛋白作为抗原，免疫实验动物（如家兔）诱导产生特异性HLX1抗体。HLX1抗体是针对人H2.0样同源盒基因编码蛋白制备的特异性免疫抗体，主流为兔源多克隆抗体。
制备方法[1]
一、HLX融合蛋白的表达与纯化（抗原制备）
原核表达载体构建以含人HLX基因ORF区（1467bp）的pMD19-T-HLX质粒为模板，通过PCR扩增HLX目的片段，经SacⅠ 和HindⅢ 双酶切后，定向克隆至原核表达载体pQE30（含 6×His标签），构建重组质粒pQE30-HLX；将其转化至E.coli M15 感受态细菌，经酶切、测序鉴定确保载体构建正确。
HLX融合蛋白的诱导表达挑取pQE30-HLX 阳性单菌落，接种于含氨苄抗性的LB培养基，37℃培养至OD₆₀₀≈0.6时，加入终浓度 1.5mmol/L的IPTG，于25℃振荡培养6h（优化后的最佳诱导条件）；收集菌液，经超声裂解（冰浴条件）、10000rpm离心20min取上清，获得含可溶性HLX融合蛋白的粗提液。
HLX融合蛋白的纯化采用Ni⁺-IMAC 亲和层析柱纯化：先用pH8.0的结合缓冲液（含50mM NaH₂PO₄、300mM NaCl、10mM咪唑）平衡柱子，上样粗提液并重复过柱；再用pH8.0的洗涤缓冲液（含20mM咪唑）洗涤去除杂蛋白；最后用pH8.0的洗脱缓冲液（含 250mM 咪唑）洗脱目的蛋白，经SDS-PAGE验证纯度达90%以上，作为免疫抗原备用。
二、免疫家兔：多克隆HLX1抗体的诱导产生
实验动物与免疫方案选用健康家兔（购自扬州大学比较医学中心），采用“基础免疫 + 加强免疫”的阶梯式免疫策略：
基础免疫：取纯化的HLX融合蛋白100μg，与等体积弗氏完全佐剂充分乳化（滴入冷水呈完整液滴视为乳化完全），于家兔背部多点皮下注射；
加强免疫：首次免疫后每10天进行1次加强免疫，共5次；加强免疫时改用HLX融合蛋白与弗氏不完全佐剂乳化，剂量同基础免疫；
末次加强与取血：第5次加强免疫后，用100μg HLX融合蛋白（无佐剂）静脉注射加强，3天后通过心脏穿刺取血，收集抗血清（含HLX1抗体）。
血清预处理收集的抗血清于4℃静置过夜，12000rpm离心10min去除沉淀，上清即为粗制HLX1抗体，可直接用于后续效价与特异性鉴定，或进一步纯化。
应用实例
许燕在转录因子Hlx(HLX1)对Th1/Th2平衡的调节及脑/脊髓损伤、胃癌的关联研究中，HLX1抗体主要用于验证Hlx基因/蛋白的表达水平，是核心检测手段之一。文中采用Western blot验证DC2.4/Hlx细胞株，提取DC2.4(未转染)、DC2.4/EGFP(空质粒)、DC2.4/mHlx(转染)细胞总蛋白，经SDS-PAGE电泳、转膜后，用1:400稀释的驴抗小鼠HLX1抗体孵育，辣根过氧化物酶标记的兔抗驴IgG为二抗，ECL显色检测。结果显示DC2.4/mHlx细胞中Hlx蛋白条带(约51kD)灰度值显著高于对照组，证实Hlx在该细胞株中稳定高表达[2]。
参考文献
[1]戴晓莉. 人HLX基因克隆表达及其功能的初步研究[D]. 江苏:江苏大学,2009. DOI:10.7666/d.y1996133.
[2]许燕. Hlx对Th1/Th2平衡的调节及其与脑/脊髓损伤关系的研究[D]. 江苏:江苏大学,2014. DOI:10.7666/d.Y2748283.