简介
普鲁兰酶(Pullulanase)是一类淀粉脱支酶，因能专一性降解普鲁兰多糖而得名。普鲁兰酶最初由Bender和Wallenfels在产气克雷伯菌(Klebsiella aerogenes)中分离获得，目前多数使用的普鲁兰酶来源于克雷伯氏菌属(Klebsiella)、嗜热杆菌属(Thermophilus)、芽孢杆菌属(Bacillus)等。普鲁兰酶根据催化机理和作用位点的不同，可分为I型和II型，I型普鲁兰酶通过内切方式将普鲁兰多糖和支链寡糖中的α-1,6-糖苷键水解为麦芽三糖和线性寡糖。工I型普鲁兰酶是双功能酶，可以水解底物多糖的α-1,6-糖苷键，同时也能内切低聚糖的α-1,4-糖苷键。
不同微生物来源的普鲁兰酶在保守功能区域具有共同的特征，包括A、B、C、F结构域以及一个活性中心和底物结合位点。其中，A结构域为8个β-折叠和8个α螺旋构成的(β/α)8桶状结构，该区域含有与活性中心相关的催化三联体结构，分别为催化亲核试剂(β-4-Asp)、质子供体(β-5-Glu)以及过渡态稳定剂(β-7-Asp)。C结构域通过β-反平行片层与A结构域的疏水基团相互作用，以维持A结构域的稳定构象。有报道称共有序列YNWGYDP是大多数I型普鲁兰酶的典型序列，与酶的催化活性和底物结合作用密切相关。然而，不同来源的普鲁兰酶结构域的氨基酸序列并不高度保守，导致了其酶学性质的差异[1]。
酶学性质
温度、pH和金属离子等会影响酶的活性及其稳定性。根据普鲁兰酶最适温度的不同，可分为常温酶(35-60℃)、嗜热酶(75℃以上)和超嗜热酶(90℃以上);根据普鲁兰酶最适pH的不同，可分为嗜酸性酶和嗜碱性酶，对应pH范围为pH3.0-6.0和pH8.0-11.0。大多数不同来源的普鲁兰酶最适温度范围为40-90℃，最适pH范围为4.0-7.0。Chen等获取的KlebsiellaI型普鲁兰醇酶最适温度为55℃，最适pH为5.0。Abbas Bukhari等筛选到的Geobacillus stearothermophilus I型普鲁兰酶最适pH为7.0，最适温度为70°C，并在90°C仍保持一定酶活性，可以满足特定工业用途。
应用
普鲁兰酶作用于α-1,6-糖苷键的特性和内在酶学性质决定了其在食品工业、淀粉加工业等行业的广泛应用。普鲁兰多糖是由α-1,4-糖苷键和α-1,6-糖苷键组成的高分子量线形多糖，普鲁兰酶因特异性水解α-1,6-糖苷键，可用于低分子量普鲁兰多糖的获取和麦芽三糖糖浆的工业生产。基于此特性，还可以与其他淀粉酶联合使用，提高淀粉转化效率，更大程度地获取葡萄糖、麦芽糖或果糖糖浆。但由于淀粉转化过程中，液化所需条件约为pH6.0和105℃，而后续糖化条件为pH4.5和60℃左右，因此普鲁兰酶需要具备一定的耐热性和耐酸性。普鲁兰酶也被用于水解淀粉中的α-1,6-糖苷键制备高直链淀粉，以获取具有更高营养价值的“抗性淀粉"。Krishnan等以水稻为模型作物，研究了普鲁兰酶在抗性淀粉形成中的新作用，并定性和定量分析验证了普鲁兰酶活性在不同发育阶段与抗性淀粉含量产生的相关性。
除此之外，普鲁兰酶也可在烘焙工业中用作保鲜剂，以改善烘焙产品的质地、体积和风味。普鲁兰酶也用作牙菌斑控制剂。一些碱性普鲁兰酶已被用作洗碗剂或作为洗衣液中的添加剂，用于在碱性条件下去除油脂和污渍。
研究现状
迄今为止，普鲁兰酶已从多种微生物中获取并得到广泛应用。用于工业生产时，普鲁兰酶需要在特定温度和pH条件下参与底物转化反应，但大多数普鲁兰酶存在稳定性差、催化效率低以及应用性能不佳等问题，常通过补加酶以保证反应正常进行，酶的过度添加或添加不足均会造成资源浪费，并且传统方法在实时快速测定酶活性方面存在一定的制约性，不利于精准控制反应过程，可能会导致反应过程的不稳定，影响终产品的质量和产量。
由此可见，目前普鲁兰酶主要存在两大问题。首先，普鲁兰酶作为一种蛋白质，易受高温、强酸或强碱等外界因素的影响，导致酶变性失活并产生沉淀，影响催化效率。为解决此问题，一些研究者通过寻找表达耐高温或耐酸碱普鲁兰酶的新菌株以提高酶的稳定性，但这种方式效率低且具有盲目性，并且天然菌株表达量较低。目前，更多的研究者致力于通过掌握蛋白酶分子的结构或序列信息，采用定点诱变或结构域修饰等方法来提高普鲁兰酶的稳定性及其活性，例如借助蛋白质工程技术基于酶蛋白的序列对现有普鲁兰酶进行改造的策略。Wang等利用生物信息学分析手段预测了B.naganoensis来源的普鲁兰酶二级结构，并通过降低二级结构的无序性发现可以有效提高普鲁兰酶的活性。蛋白质本身结构的聚集或展开是引起酶活性变化的根本原因，深入了解蛋白质结构与酶活性之间的关系，对于利用分子改遗以优化普鲁兰酶稳定性具有非常重要的意义。
其次，传统酶活性测量方法需要依赖于与某种底物系统特异性结合，通过底物耗尽或产物形成，间接测量酶的活性，具有操作复杂、耗时以及测量具有不连续性等缺点。目前常用测定普鲁兰酶活性的方法是3,5-二硝基水杨酸比色法(DNS法)，但在使用此方法时，需要考虑底物终浓度、DNS试剂与酶反应液的体积比以及反应时间等因素，并且需要仔细取样和准确控制温度以顺利进行显色反应。目前，许多研究者致力于改良现有的显色法或者研究新的酶活性测定方法，如比色法、荧光法和凝胶扩散法等。但这些方法仍需要依赖于底物，并且可能会对酶本身造成损害。因此，采用一种无损、操作简单且快速测量普鲁兰酶活性的方法对于监测反应过程至关重要[1]。
参考文献
[1] 李爽爽. 基于中红外和近红外光谱技术的普鲁兰酶活性表征与定量分析研究[D]. 山东:山东大学,2024.