丁酰柠檬酸三正己酯(BTHC)是目前市场上常用且认可度较高的一种用于聚氯乙烯(PVC)血小板液保存袋的增塑剂。相比于邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(diethylhexyl phthalate,DEHP)增塑的PVC血袋，BTHC-PVC血袋具有更高的透气性,可延长血小板的贮存时间。不仅如此,丁酰柠檬酸三正己酯在人体内的代谢产物为丁酸、己醇和柠檬酸,因此，丁酰柠檬酸三正己酯毒性较低且无明显毒副作用,安全使用剂量较高,目前已广泛应用于血小板贮存袋。四川双陆医疗器械有限公司开发了一次性使用去白细胞血小板贮存袋，目的在于对浓缩血小板进行汇集,过滤去除白细胞,然后对血小板进行保存,其中血小板贮存袋采用丁酰柠檬酸三正己酯增塑的PVC材料。根据国家对于医疗器械产品助剂含量控制要求的有关规定,需要对其增塑剂溶出进行风险评估。
对于与丁酰柠檬酸三正己酯结构十分相似的乙酰柠檬酸三丁酯(acetyl tributyl citrate,ATBC)柠檬酸类增塑剂溶出量测定的文献报道较多,方法包括气相色谱-质谱联用(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS),高效液相色谱法(HPLC)与气相色谱法(gas chromatography,GC),但是国内外尚无测定丁酰柠檬酸三正己酯在血小板制剂中溶出量的报道。因此,本文以四川双陆生产的血小板贮存袋作为研究对象，建立了HPLC定量检测混合浓缩血小板保存过程中丁酰柠檬酸三正己酯溶出量的测定方法,从而为评估丁酰柠檬酸三正己酯在临床使用中的溶出风险提供依据。
方法与结果[1]
1、试验设计
按照使用说明书用一次性使用去白细胞血小板贮存袋制备滤除白细胞的混合浓缩血小板,由BTHC增塑的血小板贮存袋保存(血小板保存箱，22±2℃,水平振荡),分别于保存第1天、第3天、第5天和第7天取样,用乙腈处理血小板样品,用高效液相色谱仪(HPLC)测定血小板中增塑剂丁酰柠檬酸三正己酯的含量,以此计算增塑剂丁酰柠檬酸三正己酯的溶出量。
2、丁酰柠檬酸三正己酯特征吸收波长的选择
精密称取丁酰柠檬酸三正己酯对照品0.01004g,用甲醇溶解并定容至10mL,得到浓度为1.004mg・mL-1的对照品储备液。用紫外/可见光分光光度计在200~300nm范围内进行全波长扫描,根据吸收光谱曲线确定HPLC检测波长为226nm,吸收光谱见图。
3、色谱条件
色谱柱: SunFire C18柱(4.6mmX150mm,5.0um,填料:十八烷基硅烷键合硅胶);柱温:30±5℃;流动相:乙腈-水(90:10);流速:1mL・min-1;进样量:20uL;保留时间0~25min;检测器;紫外/可见光检测器:波长226nm;丁酰柠檬酸三正己酯标准品的保留时间为2.70min,色谱图见图。
4、标准曲线绘制
精密称取丁酰柠檬酸三正己酯对照品0.01004g,用甲醇溶解并定容至10mL,得到浓度为1.004mg・mL-1的对照品储备液。取对照品储备液用甲醇逐级稀释,得到10、25、50、100、251、502ug・mL-1浓度的系列对照品溶液,按照“3”条件进行测定,以峰面积为纵坐标，BTHC浓度为横坐标绘制丁酰柠檬酸三正己酯标准曲线,得到线性回归方程:Y=0.3585X+0.0708；r=0.9999；表明B丁酰柠檬酸三正己酯在10ug・mL-1~502ug・mL-1浓度范围内线性关系良好。
5、灵敏度试验
取丁酰柠檬酸三正己酯对照品储备液,用甲醇逐级稀释,得到不同浓度的对照品溶液,按照“3”条件进行定量测定，以信噪比不低于3确定检测限。当丁酰柠檬酸三正己酯质量浓度为2ug・mL-1时,信噪比S/N=4.2。由此确定在“3”条件下丁酰柠檬酸三正己酯的检测限为0.04ug。
6、精密度试验
取质量浓度为502ug・mL-1、100ug・mL-1与25ug・mL-1的丁酰柠檬酸三正己酯对照品溶液,按照“2”条件分别连续定量测定5次，得到峰面积的变异系数RSD%分别为3.3%,4.3%和4.5%,均小于5%,表明此方法具有较好的仪器精密度。
7、准确度试验
精确吸取“8.2”血小板贮存袋中保存第5天的混合浓缩血小板1mL,共取4份，1份为空白,其他3份分别加入由甲醇配制的浓度为4016ug・mL-1、2008ug・mL-1和1004ug・mL-1的丁酰柠檬酸三正己酯对照品溶液50uL混匀,然后按照“8.2”方法制备供试液。按照“3”条件进行测定,根据标准曲线计算供试液中丁酰柠檬酸三正己酯的浓度。计算得到回收率为98.6 %£8.4%，以此计算血小板贮存袋保存混合浓缩血小板时丁酰柠檬酸三正己酯的溶出量。
8、血小板贮存袋保存血小板中丁酰柠檬酸三正己酯溶出量的测定
8.1、滤除白细胞的混合浓缩血小板的制备
浓缩血小板由成都市血液中心提供。选择符合国家献血标准的健康献血者,按《血站技术操作规程》采集全血400mL,采用富血小板血浆法制备浓缩血小板(PC,每袋60~70mL),质量均符合《全血及成分血质量要求》(GB 18469-2012)。将5~6袋ABO同型的浓缩血小板通过无菌接管机汇集得到一个治疗剂量的混合浓缩血小板,转移至一次性使用去白细胞血小板贮存袋产品的汇集袋中,血小板在重力作用下流经去白细胞滤器,过滤后的血小板进入血小板贮存袋中,排气后热合封闭。试验共完成5例。血小板均置于血小板保存箱,在20~24℃、振荡频率60次・min-1、振幅5cm条件下振荡保存。分别在血小板保存第1、3、5、7天从血小板贮存袋中取样测定丁酰柠檬酸三正己酯含量。
8.2、丁酰柠檬酸三正己酯溶出量的测定
取“8.1”保存的血小板样品，每例取血小板1mL作为供试液,与乙腈按1:1混合,涡旋震荡30s后5000r・min-1离心10min,上清液体积为1.5mL作为样品检测液。按照“3”色谱条件检测。根据标准曲线计算得到不同保存时间检测液浓度,从而计算血小板液丁酰柠檬酸三正己酯浓度以及1个治疗剂量(U)的混和浓缩血小板中所含丁酰柠檬酸三正己酯总量,结果见表。计算公式如下，
血小板液丁酰柠檬酸三正己酯浓度(ug・mL-1)=检测液浓度×上清液体积(1.5mL)÷供试液体积(1mL)÷回收率(98.6%)
丁酰柠檬酸三正己酯溶出总量(mg・U-1)=血小板液BTHC浓度(ug・mL-1)×浓缩血小板液体积(mL・U-1)÷1000
参考文献
[1]韩玎玎,贺曾,李婉晶,等.HPLC法测定血小板贮存袋增塑剂BTHC在混合浓缩血小板保存过程中的溶出量[J].药物分析杂志,2017,37(11):2117-2122.DOI:10.16155/j.0254-1793.2017.11.32.