产品概述

本品为艾美捷Bethyl Laboratories推出的兔源抗KAP-1（KRAB相关蛋白1）多克隆抗体（货号：A300-275A），经表位特异性亲和纯化，以未标记形式提供。KAP-1（亦称TRIM28、TIF1β）是三基序蛋白家族的成员，作为转录共抑制因子和染色质重塑复合物的支架蛋白，在基因转录调控中发挥核心作用。本抗体识别人和小鼠KAP-1蛋白，适用于免疫组织化学、免疫沉淀及免疫印迹检测，是表观遗传学、转录调控及癌症研究的实用工具。

基本规格参数

参数 具体信息

靶标 KAP-1（TRIM28/TIF1β）

反应种属 小鼠、人

应用 IHC, IP, WB

宿主 兔

克隆性 多克隆

形式 全IgG

免疫原 位于第650-700氨基酸残基之间的区域

自身抗体亚型 IgG

标记物 未标记

纯度 抗原亲和纯化

抗原种属 人

浓度 1000 µg/ml （1 mg/ml）

保存温度 2 - 8 °C

有效期 自收货之日起1年

缓冲液 Tris-柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液，pH 7-8，含0.09%叠氮钠

生产与纯化工艺

本抗体的生产采用表位特异性亲和纯化策略：

1. 免疫原设计：针对人KAP-1蛋白中第650至700位氨基酸之间的区域（参考序列NP_005753.1）。该区域位于蛋白质的PHD finger和Bromo domain之间的连接区，特异性较高。

2. 免疫程序：使用上述合成肽段对兔进行免疫，诱导产生特异性抗血清。

3. 亲和纯化：将KAP-1特异的表位肽固定于固相支持介质上，通过亲和层析从抗血清中特异性分离目标抗体。该策略确保抗体仅识别目标表位，减少非特异性背景。

4. 浓度测定：依据比尔定律，1 mg/ml IgG在280 nm波长下的吸光度（A280）为1.4。本品最终浓度为1 mg/ml（1000 µg/ml）。

表位定位：抗体识别的表位位于人KAP-1蛋白的第650-700残基之间（NP_005753.1编号）。该区域在小鼠KAP-1中高度保守，因此抗体可与小鼠源KAP-1发生交叉反应。

特异性验证

反应种属：人、小鼠

识别表位：KAP-1蛋白内部区域（650-700 aa）

经ELISA和免疫印迹验证的特异性：与人及小鼠KAP-1特异性结合

潜在交叉反应：KAP-1属于TRIM家族（含RING指、B box和卷曲螺旋结构域），与家族其他成员可能有一定同源性。本抗体是否识别TRIM28以外的蛋白未明确验证，建议在实验中设置敲低或敲除对照以确认条带特异性。

生物学背景

KAP-1（基因符号：TRIM28，GeneID: 10155，UniProt: Q13263）是转录调控和染色质重塑的关键因子：

结构特征：KAP-1包含RING指结构域、B box结构域和α螺旋卷曲螺旋区（RBCC/TRIM基序）。这些结构域介导蛋白-蛋白相互作用和酶活性（E3 SUMO连接酶和E3泛素连接酶）。

核心功能：

转录共抑制：KAP-1通过结合KRAB锌指转录抑制因子的KRAB结构域发挥作用，招募包含SETDB1组蛋白甲基转移酶和NuRD复合物等染色质修饰酶，介导H3K9me3和异染色质形成。

染色质重塑支架：作为多蛋白复合物的支架，KAP-1参与异染色质的建立和维持，在胚胎发育、基因组印记和内源逆转录病毒沉默中起关键作用。

翻译后修饰调控：KAP-1可被ATM/ATR磷酸化，响应DNA损伤信号；也可被SUMO化修饰，调节其抑制活性。

临床意义：KAP-1在多种癌症中过表达（如乳腺癌、肝癌、胶质瘤），与肿瘤进展和耐药性相关；同时也是KRAB-ZFP介导的转录抑制网络的中心节点。

应用与推荐稀释比例

以下推荐稀释比例为起始参考值。需注意，并非所有列出的应用均已在本实验室完成具体验证，建议用户根据样本类型和实验体系进行梯度优化。

应用 推荐稀释比例或用量 备注

免疫组织化学 1:1000 - 1:5000 FFPE组织切片推荐使用柠檬酸缓冲液pH6.0进行抗原修复

免疫沉淀 6 µg/mg 裂解物 即每毫克总蛋白使用6微克抗体

免疫印迹 1:2000 - 1:10,000 详见下方标准操作条件

免疫印迹标准操作条件（经实验室验证）：

封闭液和抗体稀释液：5% 脱脂牛奶-TBST

一抗孵育：过夜（4°C或室温）

细胞裂解液WB的二抗：使用山羊抗兔IgG（H+L）抗体（货号A120-101P）

免疫沉淀样本WB的二抗：使用抗兔IgG轻链HRP偶联抗体，并在封闭缓冲液中添加5%正常猪血清（货号S100-020），以避免重链交叉信号干扰

免疫组织化学（IHC）典型流程（FFPE组织切片）：

1. 脱蜡和水化

2. 抗原修复：使用柠檬酸缓冲液（pH 6.0），高压或微波加热进行抗原修复

3. 封闭内源性过氧化物酶（如适用）

4. 一抗孵育：1:1000-1:5000，4°C过夜

5. 二抗及显色

KAP-1主要定位于细胞核，在IHC中应呈现核染色模式。

免疫沉淀（IP）指南：

每毫克细胞裂解物总蛋白使用6 µg抗体

建议使用蛋白A/G琼脂糖珠（兔源抗体推荐蛋白A）

裂解缓冲液推荐使用含蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液或非变性裂解液

设正常兔IgG作为同型对照

阳性对照建议：

人源细胞系（如HeLa、HEK293T）或小鼠细胞系（如NIH/3T3）的全细胞裂解物

KAP-1表达量较高的组织（如睾丸、胚胎组织）

阴性对照建议：

使用正常兔IgG替代一抗

使用KAP-1敲低或敲除细胞裂解物（如siRNA TRIM28处理样本）

使用与保存注意事项

保存条件：请于2-8°C条件下保存，切勿冷冻。反复冻融会导致抗体变性失效。在指定条件下，自收货之日起1年内稳定有效。

缓冲液成分：本抗体溶于Tris-柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液（pH 7-8），含0.09%叠氮钠作为防腐剂。如后续实验涉及对叠氮钠敏感的酶学检测或细胞培养，请通过透析或脱盐柱去除。

稀释缓冲液建议：

WB：使用5%牛奶-TBST

IHC：使用含1% BSA或正常血清的PBS

IP：使用裂解缓冲液本身稀释抗体

分子量信息：人KAP-1蛋白的理论分子量约为89 kDa（UniProt Q13263）。在还原性SDS-PAGE中，可观察到约90-100 kDa的条带（翻译后修饰可能导致分子量偏移）。若在预测分子量以外位置观察到额外条带，可能为降解产物、SUMO化或磷酸化修饰形式。