一、产品概述

本产品由艾美捷Bethyl Laboratories推出，是一款针对人KAP-1（TRIM28）蛋白第824位丝氨酸（Ser824）磷酸化形式的特异性兔多克隆抗体（货号：A300-767A），经抗原亲和纯化制备。该抗体适用于免疫细胞化学（ICC）、免疫细胞化学/免疫荧光（ICC-IF）、免疫组化（IHC）、免疫沉淀（IP）及蛋白质印迹（WB）等多种检测方法，可同时识别人和小鼠来源的靶蛋白，仅供研究使用。

KAP-1（KRAB相关蛋白1，又称TIF1β或TRIM28）是RBCC/Trim结构域家族成员，包含RING指结构域、B盒及α螺旋卷曲区。KAP-1作为共抑制因子，通过与KRAB锌指转录抑制因子的KRAB结构域相互作用，招募染色质重塑复合物，介导转录沉默。KAP-1 Ser824位点的磷酸化是DNA损伤应答中的关键事件，由ATM/ATR激酶催化，调控KAP-1的转录抑制活性及染色质松弛。该磷酸化修饰广泛用作DNA损伤应答的标志物，特别是在电离辐射诱导的损伤研究中。

二、产品规格

参数 详细信息

靶标 KAP-1 磷酸化 (Ser824)

反应种属 小鼠， 人

应用 ICC， ICC-IF， IHC， IP， WB

宿主 兔

克隆性 多克隆

形式 完整IgG

免疫原 围绕丝氨酸824位的磷酸化合成肽

同种型 IgG

偶联物 未偶联

纯度 抗原亲和纯化

抗原种属 人

浓度 200 µg/mL

缓冲液 Tris缓冲盐水，含0.1% BSA及0.09%叠氮化钠

储存条件 2–8°C

有效期 自收货之日起1年

三、靶标详细信息

3.1 别名

KAP1， KAP-1， KRAB-associated protein 1， KRIP-1， TIF1B， TIF1-beta， RNF96， PPP1R157， E3 SUMO-protein ligase TRIM28， RING-type E3 ubiquitin transferase TIF1-beta， tripartite motif-containing protein 28。

3.2 功能背景

KAP-1是多功能核蛋白，在转录调控和DNA损伤应答中发挥核心作用：

转录共抑制：KAP-1通过其N端RBCC结构域与KRAB锌指蛋白结合，招募SETDB1组蛋白甲基转移酶、NuRD复合物及HP1蛋白，介导H3K9me3修饰和异染色质形成。

DNA损伤应答：在DNA双链断裂发生后，ATM/ATR激酶磷酸化KAP-1的Ser824位点。磷酸化的KAP-1导致染色质局部松弛，便于修复因子进入损伤位点。Ser824磷酸化是DNA损伤的重要标志物，其动力学反映损伤响应的强弱。

磷酸化调控：Ser824位于KAP-1的C端PHD结构域与溴结构域之间，磷酸化阻断KAP-1与HP1的结合，解除转录抑制。去磷酸化由PP1磷酸酶介导，恢复抑制状态。

其他功能：KAP-1还参与干细胞多能性维持、免疫调节及肿瘤抑制。

四、抗体制备与纯化

4.1 免疫原及表位定位

本抗体采用磷酸化合成肽作为免疫原。该肽段代表人KAP-1蛋白中围绕第824位丝氨酸的氨基酸序列，该丝氨酸以磷酸化形式存在（参考序列NP_005753.1）。通过使用磷酸化抗原，免疫系统产生特异性识别pSer824表位的抗体，与非磷酸化KAP-1或其他磷酸化蛋白的交叉反应极低。

4.2 纯化方法

抗体通过抗原亲和层析纯化。将磷酸化合成肽固定于固相载体，使抗血清中的特异性IgG结合于该磷酸化表位，经洗脱获得高纯度抗体。此法确保最终产品中只保留识别KAP-1 pSer824的抗体分子，保证了严格的特异性。

4.3 浓度测定

免疫球蛋白浓度采用比尔定律测定，以1 mg/mL IgG在280 nm下的吸光度（A280）为1.4作为标准。实测浓度为200 µg/mL。

4.4 缓冲液与防腐剂

抗体储存于Tris缓冲盐水（TBS），含0.1%牛血清白蛋白（BSA）作为稳定剂，及0.09%叠氮化钠作为防腐剂。BSA有助于维持低浓度抗体的稳定性，减少管壁吸附。注意：叠氮化钠有毒，操作时请佩戴防护手套。

五、储存与稳定性

收到产品后，请将抗体置于2–8°C条件下储存。切勿冷冻，反复冻融会导致抗体变性聚集、效价下降。在推荐的储存条件下，自收货之日起1年内可保持稳定。由于本抗体浓度为200 µg/mL，不建议分装冻存（低浓度抗体冻存易失活），应于2–8°C原管保存，每次取用后立即放回。

六、应用指南

以下推荐条件均经过实验验证，用户可根据具体实验体系进行优化。所有WB实验的封闭及抗体稀释均使用5%脱脂奶粉-TBST缓冲液，一抗孵育推荐4°C过夜。

6.1 蛋白质印迹（Western Blot， WB）

推荐稀释比：1:2000 – 1:10,000

样本要求：人或小鼠细胞裂解液。KAP-1分子量约110 kDa。DNA损伤处理（如电离辐射2–10 Gy，回收30分钟至4小时；紫外线照射；喜树碱或依托泊苷处理）可显著诱导Ser824磷酸化。

裂解液：必须含足量磷酸酶抑制剂（1 mM Na₃VO₄， 10 mM NaF， 20 mM β-甘油磷酸酯）。

凝胶与转膜：建议6–8% SDS-PAGE或4–12%梯度胶。常规湿转（100V，90分钟）。

二抗选择：

细胞裂解液WB：使用山羊抗兔IgG（重链+轻链）HRP标记二抗（如A120-101P）。

免疫沉淀后WB：建议使用抗兔IgG轻链HRP标记二抗，并在封闭缓冲液中加入5%正常猪血清（货号S100-020），避免检测到IP抗体的重链（55 kDa）和轻链（25 kDa）。

阳性对照：使用经10 Gy电离辐射处理后回收1小时的人HeLa细胞裂解液。未处理细胞作为阴性对照（基础磷酸化水平极低）。

6.2 免疫沉淀（Immunoprecipitation， IP）

推荐用量：每毫克细胞裂解液总蛋白使用6 µg抗体。由于浓度200 µg/mL，6 µg抗体体积为30 µL。

操作建议：同标准IP流程。注意裂解液需含磷酸酶抑制剂，以维持磷酸化状态。建议设置非特异性兔IgG作为阴性对照。

6.3 免疫组化（Immunohistochemistry， IHC）

推荐稀释比：1:100 – 1:500

样本类型：福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）组织切片

抗原修复：推荐使用柠檬酸缓冲液（pH 6.0），高压或微波加热修复。磷酸化表位对修复条件敏感，建议优化时间（微波高火15分钟）。

检测：可使用HRP/DAB或荧光二抗。建议设置未处理对照组织及已知DNA损伤处理组织（如肿瘤组织或辐照组织）作为阳性对照。

6.4 免疫细胞化学（ICC）与免疫细胞化学/免疫荧光（ICC-IF）

推荐稀释比：1:200 – 1:1000

固定与透化：推荐4%多聚甲醛固定15–20分钟，随后0.2–0.5% Triton X-100透化10分钟。不推荐丙酮固定，可能破坏表位。

预期定位：DNA损伤后，KAP-1 pSer824在细胞核中呈现点状或弥散分布，与DNA损伤位点共定位。

对照：未处理细胞信号应极弱；辐照或药物处理的细胞显示强核信号。

七、参考文献（部分）：

Ziv Y， et al. (2006) *Nat Cell Biol* 8: 870–876.

Goodarzi AA， et al. (2008) *J Cell Biol* 182: 283–295.

White D， et al. (2017) *DNA Repair* 56: 114–121.

注意：本产品仅限研究使用，不得用于诊断或治疗。用户应自行验证抗体在其特定实验体系中的适用性。以上信息覆盖了本抗体的全部规格、制备细节、多平台应用参数及背景知识，使用者可据此快速建立KAP-1 Ser824磷酸化检测方案，获得特异、灵敏且可重复的结果。