1. 产品概述
由艾美捷代理BPS Biosciences推出的重组人丝氨酸/苏氨酸激酶ARAF（A-Raf原癌基因丝氨酸/苏氨酸激酶）（GST-His双标签，Y301D/Y302D突变体）（货号：40010）的激酶结构域片段，覆盖氨基酸282–606（C端全长），携带Y301D和Y302D两处位点特异性突变。构建体N端融合GST标签、C端融合6×His标签，经亲和层析纯化。该产品适用于MAPK/ERK信号通路研究、ARAF特异性抑制剂筛选及激酶选择性谱分析。
项目 | 规格
构建体 | GST-ARAF(282–606端)-His
突变 | Y301D + Y302D
标签 | N端GST标签 + C端6×His标签
宿主/表达系统 | Sf9昆虫细胞
分子量 | 63 kDa
纯度 | ≥61%
比活力 | 6 pmol/min/µg
剂型 | 水相缓冲液
保存稳定性 | -80°C下至少6个月
2. 背景与功能
ARAF是RAF激酶家族（ARAF、BRAF、CRAF）的重要成员，在RAS-RAF-MEK-ERK（MAPK）信号级联中发挥核心承接作用。当RAS被上游生长因子受体激活后，RAF家族成员被招募至质膜并磷酸化激活，进而磷酸化下游MEK1/2，最终驱动ERK1/2介导的转录程序和细胞增殖、分化、存活等命运决定。
ARAF的临床相关性日益受到关注：ARAF基因突变已在多种实体瘤（肺癌、结直肠癌、胰腺癌、黑色素瘤）中报道，其过表达或异常激活也被发现与BRAF抑制剂（如维莫非尼、达拉非尼）的获得性耐药相关——在BRAF V600E突变的黑色素瘤中，ARAF的代偿性激活可重新启动MEK-ERK信号，绕过BRAF的抑制。因此，开发特异性靶向ARAF的抑制剂成为克服耐药的重要策略之一。
3. 产品设计与质量控制
3.1 构建体设计
截短策略：仅表达激酶结构域（282–606），去除N端调控区，使蛋白始终保持活性构象，避免RAS结合状态对酶活性测定的干扰，更适用于基于底物磷酸化的体外活性筛选。
突变引入（Y301D/Y302D）：将301和302位的酪氨酸置换为天冬氨酸，模拟磷酸化状态下的负电荷环境，使激酶处于组成性激活构象。这一设计突破了野生型ARAF体外活性低下的瓶颈，显著提升比活力至可检测水平（6 pmol/min/µg），保证筛选体系信噪比。
双标签设计：N端GST标签增强融合蛋白的溶解性并维持激酶结构域的折叠稳定性；C端His标签提供另一种亲和纯化/检测选项，两个标签分列两端避免单一标签可能引起的空间掩蔽效应。
3.2 纯度与活力
SDS-PAGE鉴定纯度≥61%。需注意该蛋白分子量（63 kDa）中GST标签占相当比例（约26 kDa），应结合抗ARAF特异性抗体的Western blot双重确认主条带为目的蛋白。
比活力6 pmol/min/µg（以MEK1为底物，通过ADP-Glo™发光法检测）。该活力值足以支持IC₅₀测定的动态范围（信噪比≥5倍），且批次间CV控制在可接受范围内。
3.3 缓冲体系
组成为40 mM Tris-HCl（pH 8.0）、110 mM NaCl、2.2 mM KCl、0.04% Tween-20、20%甘油、3 mM DTT。关键组分功能：Tween-20防止蛋白聚集并降低高通量筛选的孔间变异；DTT维持激酶结构域中关键半胱氨酸的还原状态；甘油支持长期低温保存时的构象稳定性。
4. 使用与保存指南
4.1 操作步骤
1. 冰上解冻，轻柔混匀（严禁涡旋振荡——涡旋产生的剪切力可破坏激酶疏水核心结构，导致不可逆聚集）；
2. 解冻后快速离心（10,000×g，10秒）以收集管壁及盖内液滴；
3. 按单次用量分装，液氮速冻后转回-80°C长期保存；
4. 避免反复冻融（每轮冻融可损失20–40%活性）。
4.2 应用建议
激酶活性测定：推荐反应体系为40 mM Tris-HCl（pH 7.5）、10 mM MgCl₂、1 mM MnCl₂、1 mM DTT、100 µM ATP及底物MEK1（0.5–2 µg/反应），反应温度30°C，时间30–60分钟。
抑制剂筛选：阳性对照可采用泛RAF抑制剂（如GW5074）或索拉非尼。需设置ATP固定和ATP可变两种筛选模式以区分竞争与非竞争性抑制机制。
选择性谱分析：由于RAF家族三成员激酶结构域高度同源（70–80%），建议对候选化合物进行三成员平行筛选。本产品的Y301D/Y302D激活突变设计特别适合与野生型BRAF/CRAF对比，以区分靶向活性构象和非活性构象的化合物差异。
5. 注意事项
运输与接收：干冰运输，到货后立即存入-80°C，避免存放于自动除霜冰箱。
DTT补充：长期保存后（>3个月），建议在使用前向反应体系中补加新鲜DTT至终浓度1–5 mM。
去污剂兼容性：产品含0.04% Tween-20，若下游实验（如SPR）对去污剂敏感，需通过脱盐柱更换缓冲液（低温快速操作，监测浊度以防聚集）。
安全性：本品仅供研究用途（Research Use Only），ARAF为原癌基因产物，操作时遵循BSL-2规范。
6. 参考文献
1. Yokoyama,T. et al. J. Cell Biol. 177 (5), 781- 793 (2007).
2. Ewing,R.M. et al. Mol. Syst. Biol. 3, 89 (2007).