一、产品背景与检测原理

报告基因技术是分子生物学研究中监测基因表达调控的重要手段。常用的报告基因包括β-半乳糖苷酶基因、β-葡萄糖醛酸酶基因和荧光素酶基因等。其中，荧光素酶报告基因检测体系凭借其独特的优势，成为目前应用最为广泛的报告基因检测方法之一。

荧光素酶报告基因检测的主要优势包括：灵敏度极高、多数细胞类型内源无荧光素酶活性背景干扰、动态范围宽、检测速度快以及成本较低。在众多来源的荧光素酶中，应用最为广泛的是来源于北美萤火虫（Photinus pyralis）的荧光素酶。该酶具有以下突出特点：无需翻译后修饰即可获得酶活性、在体内高浓度条件下仍无明显细胞毒性，且可在原核细胞和真核细胞中稳定表达。

萤火虫荧光素酶催化D-荧光素发生ATP依赖性的生物发光氧化反应，反应需ATP、镁离子和氧气的参与，发射峰值波长为560 nm的可见光。该反应产生的发光强度与荧光素酶活性呈正比，从而可准确反映报告基因的表达水平。

由艾美捷代理AAT Bioquest推出的本试剂盒（Amplite™ 荧光素酶报告基因检测试剂盒，Bright Glow）货号：AAT-12518，采用专利配方的发光底物体系，可对活细胞及细胞裂解液中的荧光素酶活性进行定量检测。该配方在与荧光素酶反应后产生高强度的稳定发光信号，具有持续性强、半衰期长的特点，适合动力学检测和批量样本读取。试剂盒提供“混合即读”的优化检测方案，与高通量筛选液体处理工作站兼容，具有极高的灵敏度，可满足对检测灵敏度有严格要求的实验需求。

二、试剂盒规格与储存条件

本试剂盒提供以下规格供选择：

产品编号 | 规格（检测次数）

Cat. #12518 | 小包装

Cat. #12519 | 中包装（需加入10 mL反应缓冲液）

Cat. #12520 | 大包装（需加入100 mL反应缓冲液）

使用前请将所有组分置于室温条件下解冻。对于所有发光检测实验，建议使用白色微孔板以获得最佳检测效果。

三、工作液配制方法

1. Cat. #12518规格：

将反应缓冲液（Component B）全部转移至荧光素酶传感器（Component A）瓶中，充分混匀，即得荧光素酶传感器工作液。

2. Cat. #12519及Cat. #12520规格：

-Cat. #12519：向荧光素酶传感器（Component A）瓶中加入10 mL反应缓冲液（Component B），充分混匀。

-Cat. #12520：向荧光素酶传感器（Component A）瓶中加入100 mL反应缓冲液（Component B），充分混匀。

-将混匀后的溶液转移回反应缓冲液原瓶（Component B）中，需进行多次润洗以确保内容物完全转移。

> 注：配制后的荧光素酶传感器工作液稳定性有限，需注意避光保存，建议在配制后尽快使用。

四、实验操作流程

1. 细胞（样品）制备与化合物处理

-96孔板体系：每孔加入10 μL 10×待测化合物（溶于适宜的化合物缓冲液中），并加入细胞悬液使总体积为100 μL。

-384孔板体系：每孔加入5 μL 5×待测化合物，并加入细胞悬液使总体积为25 μL。

-空白对照孔（无细胞，仅含培养基）加入相应体积的化合物缓冲液。

2. 细胞孵育

将细胞培养板置于37°C、5% CO₂培养箱中孵育所需时间，通常为4小时至过夜，具体时间根据实验设计确定。

3. 加入检测工作液

-96孔板体系：每孔加入100 μL荧光素酶传感器工作液。

-384孔板体系：每孔加入25 μL荧光素酶传感器工作液。

4. 孵育

室温条件下避光孵育10～20分钟。

5. 信号检测

使用发光检测仪（Luminometer）读取发光强度值。

五、关键实验参数

-检测仪器：发光微孔板检测仪（Luminometer）

-检测波长：560 nm（峰值发射波长）

-推荐板型：白色实心底微孔板

-操作模式：混合即读，无需洗涤步骤

六、实验优化建议

1. 细胞数量优化：建议根据细胞类型和实验目的优化每孔细胞接种密度，以确保发光信号在仪器检测线性范围内。通常建议贴壁细胞每孔接种1×10⁴～5×10⁴个细胞（96孔板）。

2. 化合物处理时间优化：不同化合物和信号通路对处理时间的要求不同，建议在正式实验前进行时间梯度预实验，以确定最佳孵育时间。

3. 工作液稳定性：配制后的荧光素酶传感器工作液对光敏感，建议现配现用，避免长时间光照或高温保存。

4. 板型选择：白色微孔板可最大限度地反射发光信号，提高检测灵敏度和信号强度。避免使用透明底或黑色微孔板进行发光检测。

5. 背景控制：设置无细胞空白对照孔和无荧光素酶阴性对照孔，以扣除背景信号。