一、产品背景与检测原理

Caspase家族是一类在细胞凋亡进程中发挥核心作用的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶。其中，Caspase-3和Caspase-7作为效应型Caspase，在凋亡信号通路的执行阶段扮演着关键角色，是细胞凋亡检测的重要分子靶标。

高纯度R110（罗丹明110）衍生底物以内酯构型存在时，表现为无色且无荧光特性。当该底物被Caspase-3/7特异性酶切后，释放出游离的R110荧光染料，产生强烈的绿色荧光信号。该荧光信号可在激发波长488 nm（荧光仪器中最常用的激发光源）、发射波长510～530 nm处进行荧光检测。R110衍生Caspase底物是当前广泛应用于Caspase家族酶活性荧光检测的高灵敏度指示剂之一。

本底物（(Z-DEVD)₂-R110）由艾美捷代理AAT Bioquest推出，货号：AAT-13430，是针对Caspase-3/7的特异性荧光底物。其分子结构中包含两个DEVD（天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸）多肽序列，与R110荧光染料偶联形成二聚体结构。在Caspase-3/7酶活性作用下，DEVD序列被特异性剪切，释放出游离的R110，产生荧光信号增强，信号强度与Caspase-3/7活性呈正比。

本产品经高度纯化处理，可有效消除痕量游离R110的残留——此类微量杂质虽无法通过HPLC检出，但足以导致显著的检测背景信号。高度纯化的工艺确保了本底物具有极低的背景荧光和优异信噪比。

二、产品储存与稳定性

-储存条件：产品应储存于-15°C以下环境中，置于阴凉避光处保存。

-有效期：自收货之日起12个月内使用有效。

-储备液保存：未使用的储备液建议分装为单次用量，于-20°C保存，避免反复冻融。

三、储备液配制方法

(Z-DEVD)₂-R110储备液（10 mM）

向含1 mg (Z-DEVD)₂-R110的瓶中加入65 μL DMSO，充分溶解，即得10 mM储备液。

四、工作液配制方法

Caspase-3/7检测反应液（2×）

按以下配方混合配制2×检测反应液：

组分 | 用量

(Z-DEVD)₂-R110储备液（10 mM） | 50 μL

DTT（1 M） | 100 μL

EDTA（100 mM） | 400 μL

Tris缓冲液（20 mM，pH 7.4） | 10 mL

充分混匀后即得2× Caspase-3/7检测反应液，注意避光保存。

五、实验操作流程

1. 样品与反应液混合

将Caspase-3/7标准品或待测样品与等体积的2×检测反应液充分混合。

2. 孵育反应

室温条件下孵育至少1小时，使酶切反应充分进行。

3. 荧光信号检测

使用荧光微孔板酶标仪，在激发波长490 nm/发射波长525 nm处监测荧光强度随时间的变化。建议采用动力学读数模式，以获取初始反应速率（V₀）进行更为准确的酶活性定量分析。

六、关键实验参数

-检测仪器：荧光微孔板酶标仪（具备动力学读数功能）

-激发波长：490 nm

-发射波长：525 nm

-推荐板型：黑色实心底微孔板（以减少孔间信号串扰）

七、实验优化建议

1. 酶量与孵育时间优化

建议根据实验体系中Caspase-3/7的预期活性水平，对孵育时间进行梯度预实验（30分钟～2小时），以确保荧光信号处于仪器检测的线性范围内。

2. 阳性对照设置

建议使用已知Caspase-3/7诱导剂（如Staurosporine或TRAIL）处理的细胞裂解液作为阳性对照，以确保检测体系的有效性。

3. 背景扣除

设置无酶阴性对照孔（以等体积缓冲液替代样品），用于扣除背景荧光信号。

八、注意事项

1. 避光操作：R110荧光染料对光敏感，底物储备液、工作液及反应体系均需注意避光保存和操作，避免长时间暴露于光照条件下。

2. 低温保存：底物稳定性与温度密切相关，未使用的储备液应及时转移至-20°C保存，避免反复冻融。

3. DTT浓度控制：DTT是维持Caspase酶活性的必要还原剂，但过高浓度可能对酶活性产生抑制，建议严格按照推荐浓度使用。

4. pH控制：检测反应液pH值应严格控制在7.4左右，偏离该范围可能影响酶活性及底物反应效率。

5. 产品用途限制：本产品仅供科研使用，不得用于临床诊断或治疗。对于潜在危险化学品的处理，请参考产品附带的安全数据表（SDS）。