霍乱弧菌CTXA/CTXB基因（ctxA/B）双重核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)

[产品名称]

商品名称：霍乱弧菌 CTXA/CTXB 基因（ctxA/B）双重核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)

Name ： Diagnostic Kit for Vibrio cholerae CTXA and CTXB gene (Real-Time PCR Method)

[包装规格]25 人份/盒、50 人份/盒

[预期用途]

霍乱弧菌（Vibrio cholerae）属于弧菌属，革兰氏阴性菌，是烈性肠道传染病霍乱的病原体。霍乱是一种流行广泛的烈性传染病，在世界范围出现多次大流行，病死率甚高，被列为国际进出口检疫A类传染病之一。

本试剂盒适用于检测样品霍乱感染或疑似感染病例的排泄物、呕吐物；被霍乱弧菌污染或有霍乱弧菌污染嫌疑的交通工具、行李、货物、集装箱、邮包、水产品、食品、饮用水、压舱水、污水、餐饮用具、生活用品。适用于霍乱肠毒素 CTX 感染的辅助诊断及流行病学调查，其检测结果仅供参考。

[检验原理]

本试剂盒分别根据霍乱弧菌CTXA/CTXB基因、人内源性基因高度保守区域设计的特异性引物和荧光探针，用一步法荧光 RT-PCR 技术对霍乱弧菌 CTXA/CTXB 基因的 DNA 进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染病料的病原学诊断。

[试剂组成]

说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用。

[储存条件及有效期]

-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融不超过 5 次。有效期 12 个月。

[适用仪器]

ABI7500、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。

[样品采集]

从水样粪便，疑似污染的水、食物等样本提取的 DNA 样本。

[保存和运输]

采集或处理好的样品在 2℃~8℃条件下保存应不超过 24 h；若需长期保存，应放置-70℃以下保存，冻融不超过 3 次。

[使用方法]

1. 样品处理（样品处理区）

1.1 样品前处理

霍乱弧菌检测样本的处理见《国境口岸霍乱检验规程》（SN/T1239-2015）附录 A。

1.2 核酸提取

推荐采用核酸提取或纯化试剂（磁珠法或离心柱法）进行核酸提

取，请按照试剂说明书进行操作。

2. 试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样品总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样品数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；反应管数每满 10 份，多配制 1 份)，每测试反应体系配制如下表：

将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，20μL/管。

3. 加样（样品处理区）

将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 5μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。

4. PCR 扩增（核酸扩增区）

4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；

4.2 设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；荧光通道选择： 检测通道（Reporter Dye）FAM、VIC、CY5， 淬灭通道（Quencher Dye）选择 NONE，请勿选择 ROX 参比荧光。

4.3 推荐循环参数设置：

5. 结果分析判定

5.1 结果分析条件设定（请参照各仪器使用说明书进行设置，以分析 ABI7500 仪器为例）

反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节 Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用户可根据实际情况自行调整，Start 值可设在 3～15、End 值可设在 5～20，使阈值线位于扩增曲线指数期，阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线），点击 Analyze 自动获得分析结果。

5.2 结果判断

FAM 通道为霍乱弧菌 CTXB 检测结果，VIC 通道为人内源性基因检测结果，CY5 通道为霍乱弧菌 CTXA

检测结果

阳性：检测通道 Ct 值≤40，且曲线有明显的指数增长曲线；

阴性：样品检测结果 Ct 值>40 或无 Ct 值。

5.3 质控标准

阴性质控品：无特异性扩增曲线或无 Ct 值；

阳性质控品：扩增曲线有明显指数增长期，且 Ct 值≤32；

以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

6. 检测方法的局限性

1.样品检测结果与样品收集、处理、运送以及保存质量有关；

2.样品提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；

3.阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；

4.病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；

5.不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；

6.试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；

7.本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

[注意事项]

1.所有操作严格按照说明书进行；

2.试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；

3.反应液应避光保存；

4.反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；

5.使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；

6.样品处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；

7.实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

8 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。