五种致泻性大肠埃希氏菌核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）

[产品名称]

商品名称：五种致泻性大肠埃希氏菌核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）

Name：Multiplex Real-Time PCR Diagnostic Kit for Five Kinds of Cathartic Escherichia coli nucleic(Real-Time PCR Method)

[包装规格]25T/盒、50T/盒

[预期用途]

常见的致泻大肠埃希氏菌主要包括肠道致病性大肠埃希氏菌（Enteropathogenic Escherichia coli，EPEC）、肠道侵袭性大肠埃希氏菌（Enteroinvasive Escherichia coli，EIEC）、产肠毒素大肠埃希氏菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）、肠道出血性大肠埃希氏菌（Enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC）和肠道集聚性大肠埃希氏菌（Enteroaggregative Escherichiacoli，EAEC）5 种。

本试剂盒适用于这五种致泻性大肠埃希氏菌感染的辅助诊断及流行病学调查，其检测结果仅供参考。

[检验原理]

本试剂盒采用实时荧光 PCR 技术，针对五种致泻性大肠埃希氏菌的 12 个基因的序列保守区域分别设计特异性引物和Taqman 荧光探针，实现对五种致泻性大肠埃希氏菌中 DNA 的定性检测。

说明：不同批次试剂盒成分不可混用！

[储存条件及有效期]

-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融不超过 5 次，有效期 12 个月。

[适用仪器]

ABI7500、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。

[标本采集]

从临床样本、食品样品、增菌液及其培养物中提取的 DNA 样本。

[保存和运输]

采集或处理好的样品在 2℃~8℃条件下保存应不超过24 h；若需长期保存，应放置-70℃以下保存，冻融不超过 3次。

[使用方法]

1. 样品处理（样本处理区）

1.1 样本前处理

采用商品化试剂盒，按照试剂盒说明书进行操作。

1.2 核酸提取

推荐采用核酸提取或纯化试剂（磁珠法或离心柱法）进行核酸提取，请按照试剂说明书进行操作。

2. 试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；样品每满 10 份，多配制 1 份)。每管反应液同样配置。

分别将 3 个混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，20μL/管。

3. 加样（样本处理区）

将步骤1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 5μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。

4. PCR扩增（核酸扩增区）

4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR仪反应槽内；

4.2 设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；荧光通道选择： 检测通道（Reporter Dye）FAM，VIC 或 HEX，ROX，CY5， 淬灭通道（Quencher Dye）选择 NONE，ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光，选择 None 即可。

4.3 推荐循环参数设置：

*其它仪器比如 ABI7500 采集荧光设定为 31sec，对结果无影响。

5.1 结果分析条件设定（请参照各仪器使用说明书进行设置，以分析 ABI7500 仪器为例）

反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节 Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用户可根据实际情况自行调整，Start 值可设在 3～5、End 值可设在 10～15，使阈值线位于扩增曲线指数期，阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线），点击 Analyze自动获得分析结果。

5.2 结果判断

阴性：样本检测结果 Ct 值>35 或无 Ct 值。

阳性：检测通道有明显的指数增长曲线，且 Ct 值≤35。

*astA pic 基因可在细菌间转移，当与其他毒力基因同时阳性时，astA pic 基因不作为型别判定依据。如检测 uidA ltastA同时阳性，则判定该菌株为 ETEC；检测 uidA ipaH pic 同时阳性，则判定该菌株为 EIEC。注意：

EPEC/EHEC/EIEC/ETEC/EAEC 的结果判读标准来源于 GB4789.6-2016。

5.3 质控标准

阴性质控品：阴性对照 Ct值>35或无特异性扩增曲线；

阳性质控品：扩增曲线有明显指数增长期，且 Ct 值≤32；

以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

6.检测方法的局限性

1.样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；

2.样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；

3.阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；

4.病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；

5.不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；

6.试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；

7.本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

[注意事项]

1.所有操作严格按照说明书进行；

2.反应体系应避光干燥保存；

3.反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；

4.使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；

5.样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；

6.实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

7.试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。