丙酮酸羧化酶（PC)试剂盒说明书
微量法 100 管/96 样
正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase，PC，EC 6.4.1.1)广泛存在于动物、霉菌和酵母的线粒体中，催化 丙酮酸、ATP、CO2和水生成草酰乙酸、ADP 和 Pi，是糖异生过程的第一个限速酶，在保证血糖的动态平 衡方面起着重要的作用。
测定原理：
PC 催化丙酮酸、ATP、CO2 和水生成草酰乙酸、ADP 和 Pi，苹果酸脱氢酶进一步催化草酰乙酸和 NADH 生成苹果酸和 NAD+，在 340nm 下测定 NADH 氧化速率，即可反映 PC 活性。
自备仪器和用品：
分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。
样本前处理：
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
1、 称取约 0.1g 组织或收集 500 万细菌或细胞，加入 1ml 提取液，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2、 将匀浆 600g，4℃离心 5min。
3、 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。
4、 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的 PC（此步可选做）。
5、 在步骤④的沉淀中加入 1ml 提取液，超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3 秒，间隔 10 秒，重复 30 次），用于线粒体 PC 活性测定。
测定步骤：
1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。 工作液的配制：临用前将试剂二和试剂三转移到试剂一中混合溶解待用；置于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其 它物种)预热 5 分钟；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。 试剂四的配制：在试剂四瓶中加入 1mL 蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻 融。
2、在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 样本、10μL 试剂四和 180μL 工作液，立即混匀，记录 340nm 处初始吸光值 A1 和 2min 后的吸光值 A2，计算ΔA=A1-A2。 注意：在该试剂盒中，若ΔA 大于 0.5，需将样本用提取液稀释适当倍数后测定，使ΔA 小于 0.5 可提高检 测灵敏度。计算公式中乘以相应稀释倍数。
关键字： 丙酮酸羧化酶（PC）检测试剂盒;
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