产品原理
本试剂盒采用实时荧光定量PCR技术，基于TaqMan探针原理设计。探针5'端标记荧光报告基团，3'端标记荧光淬灭基团。在PCR扩增过程中，Taq酶的5'-3'核酸外切酶活性会切割与靶序列结合的探针，使报告基团与淬灭基团分离，产生荧光信号。通过实时监测荧光信号变化，可对升麻DNA进行定性和定量分析。
产品名称 | 升麻探针法PCR鉴定试剂盒 | 英文名称 | Rhizoma Cimicifugae Probe-based PCR Identification Kit |
产品规格 | 50T | 产品分类 | 荧光定量PCR |
检测类型 | PCR检测 | 产品货号 | PR4979 |
产品特点
高灵敏度：优化的引物和探针设计可检测低拷贝数模板
高特异性：针对升麻高度保守区设计，无交叉反应
操作简便：即开即用，预混试剂减少操作步骤
质量控制：提供阳性对照(1×10⁸拷贝/μL)用于实验验证
稳定性好：-20℃保存条件下有效期达12个月
试剂盒组成
| 成分 | 规格 | 主要功能 |
| 探针法qRT-PCR缓冲液 | 500μL | 提供反应缓冲环境 |
| 探针法qRT-PCR酶混合液 | 100μL | 包含逆转录酶和DNA聚合酶 |
| 荧光PCR专用模板稀释液 | 1mL | 用于标准品稀释 |
| 升麻探针法qRT-PCR引物混合液 | 100μL | 特异性扩增引物 |
| 升麻qRT-PCR探针 | 50μL | 特异性检测探针 |
| 升麻探针法qRT-PCR阳性对照 | 50μL | 阳性对照(1×10⁸拷贝/μL) |
| 产品说明书 | 1份 | 使用指南 |
实验前准备
仪器设备：实时荧光定量PCR仪、离心机、冰盒、微量移液器及无菌枪头
耗材：无菌PCR管、带滤芯枪头
样品要求：提供纯化的DNA模板，浓度建议50ng-1μg/μL
标准曲线制备
标记6个离心管(2-7号)，各加入45μL模板稀释液
在7号管中加入5μL阳性对照，震荡混匀，得到10⁷拷贝/μL标准品
依次进行10倍梯度稀释，得到10⁶-10²拷贝/μL系列标准品
所有稀释操作应在独立区域进行，避免交叉污染
PCR反应体系
反应体积：20μL
反应组分：
探针法qRT-PCR缓冲液：10μL
探针法qRT-PCR酶混合液：2μL
升麻qRT-PCR探针：1μL
升麻探针法qRT-PCR引物混合液：2μL
模板DNA：5μL
PCR反应程序
| 步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
| 逆转录 | 50℃ | 30分钟 | 1 |
| 预变性 | 94℃ | 10分钟 | 1 |
| 变性 | 94℃ | 15秒 | 40 |
| 退火/延伸 | 60℃ | 1分钟 | 40 |
| (采集FAM通道荧光信号) | | | |
结果分析
定量分析
以阳性对照浓度的log值为横轴，Ct值为纵轴绘制标准曲线
根据样品Ct值推算初始模板浓度
定性分析
阴性对照：Ct值≥40
阳性对照：Ct值≤30且有典型扩增曲线
样品判定：
Ct值≤35：阳性
Ct值≥40：阴性
35<Ct值<40：需重复检测
注意事项
所有操作应在无菌环境下进行，避免污染
建议使用带滤芯枪头，防止气溶胶污染
标准品稀释与样品处理应在不同区域进行
反应体系配制应置于冰上进行
本产品仅限科研使用，不可用于临床诊断
试剂解冻后应充分混匀，避免反复冻融
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