技术原理
本试剂盒采用实时荧光定量PCR（qPCR）技术中的探针法原理。探针5'端标记荧光报告基团，3'端标记淬灭基团。在PCR扩增过程中，Taq酶的5'核酸外切酶活性会切割与靶序列结合的探针，使报告基团与淬灭基团分离，产生荧光信号。通过实时监测荧光强度的变化，实现对当归样品中目标序列的定量和定性分析。
产品名称 | 当归探针法PCR鉴定试剂盒 | 英文名称 | Radix Angelicae Sinensis Probe-based PCR Identification Kit |
产品规格 | 50T | 产品分类 | 荧光定量PCR |
检测类型 | PCR检测 | 产品货号 | PR5145 |
产品特点
即开即用，操作简便
高灵敏度：引物和探针经过优化设计
高特异性：针对当归高度保守区设计，避免交叉反应
提供阳性对照（1×10⁸拷贝/μL），便于区分假阴性结果
兼容多种RNA提取方法
试剂盒组成
| 成分 | 规格 |
| 探针法qRT-PCR缓冲液 | 500μL |
| 探针法qRT-PCR酶混合液 | 100μL |
| 荧光PCR专用模板稀释液 | 1mL |
| 当归探针法qRT-PCR引物混合液 | 100μL |
| 当归qRT-PCR探针 | 50μL |
| 当归探针法qRT-PCR阳性对照 | 50μL |
| 说明书 | 1份 |
储存与运输
运输条件：低温运输
保存温度：-20℃
有效期：12个月
注意事项：避免反复冻融
实验前准备
自备试剂与设备
样品RNA提取试剂
实时荧光定量PCR仪
无核酸酶离心管和枪头
冰盒
涡旋振荡器
微量移液器
样品处理要求
血清/血浆：3000rpm离心10-30分钟分离
细胞上清液：3000rpm离心10分钟
组织匀浆：加入生理盐水匀浆后离心
保存：如不立即检测，应分装后-20℃保存，避免反复冻融
操作步骤
标准曲线制备（以6个10倍稀释度为例）
标记6个离心管（7-2号）
每管加入45μL模板稀释液
7号管加入5μL阳性对照（1×10⁸拷贝/μL），震荡混匀，得到1×10⁷拷贝/μL标准品
依次稀释至1×10²拷贝/μL
RNA提取
建议使用柱式病毒RNA提取试剂盒，或兼容的其他RNA提取方法
PCR反应体系（20μL）
| 成分 | 样品管(N+2) | 阴性对照 | 标准曲线管 |
| qRT-PCR缓冲液 | 各10μL | 10μL | 各10μL |
| qRT-PCR酶混合液 | 各2μL | 2μL | 各2μL |
| qRT-PCR探针 | 各1μL | 1μL | 各1μL |
| 引物混合液 | 各2μL | 2μL | 各2μL |
| RNA模板 | 各5μL | - | - |
| 超纯水 | - | 5μL | - |
| 标准品 | - | - | 各5μL |
PCR反应程序
| 步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
| 逆转录 | 50℃ | 30min | 1 |
| 预变性 | 94℃ | 10min | 1 |
| 变性 | 94℃ | 15sec | 40 |
| 退火/延伸 | 60℃ | 1min | 40 |
| 信号采集 | 60℃ | - | 40 |
结果分析
定量分析
以阳性对照浓度的log值为横轴，Ct值为纵轴绘制标准曲线
根据样品Ct值推算RNA浓度
定性分析
阴性对照：Ct≥40或无Ct值
阳性对照：Ct≤30，有明显扩增曲线
样品判定：
Ct<35：阳性
Ct≥40：阴性
35≤Ct<40：需重复实验确认
注意事项
实验分区操作，避免污染
使用带滤芯枪头
反应体系配制应在冰上进行
阳性对照最后加入
本产品仅限科研使用
避免反复冻融试剂
质量控制
阴性对照应无扩增（Ct≥40）
阳性对照应有明显扩增曲线且Ct≤30
标准曲线相关系数R²应≥0.98
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