检测原理
基于实时荧光定量PCR（qPCR）探针法技术：
探针设计：5'端标记荧光报告基团，3'端标记淬灭基团，通过Taq酶的5'→3'外切酶活性切割探针，释放荧光信号。
定量分析：荧光信号强度与扩增产物量成正比，通过标准曲线计算起始模板浓度。
高特异性：引物及探针针对百部保守序列设计，避免交叉反应。
产品名称 | 百部探针法PCR鉴定试剂盒 | 英文名称 | Radix Stemonae Probe-based PCR Identification Kit |
产品规格 | 50T | 产品分类 | 荧光定量PCR |
检测类型 | PCR检测 | 产品货号 | PR5208 |
试剂盒组成
| 成分 | 规格/体积 |
| 探针法qRT-PCR缓冲液 | 500 μL |
| 酶混合液 | 100 μL |
| 荧光PCR模板稀释液 | 1 mL |
| 百部特异性引物混合液 | 100 μL |
| 百部qPCR探针 | 50 μL |
| 阳性对照（1×10⁸拷贝/μL） | 50 μL |
| 说明书 | 1份 |
实验步骤
1. 标准曲线制备（10倍梯度稀释）
标记离心管（7~2号），依次用稀释液将阳性对照稀释至10⁷~10²拷贝/μL（每步换枪头，冰上操作）。
2. 样品RNA提取
建议设置阴性/阳性对照（N+2）。
使用兼容的RNA提取试剂盒纯化样本，避免污染。
3. qPCR反应体系（20 μL）
| 成分 | 样品管（μL） | 阴性对照（μL） | 标准曲线管（μL） |
| qRT-PCR缓冲液 | 10 | 10 | 10 |
| 酶混合液 | 2 | 2 | 2 |
| 探针 | 1 | 1 | 1 |
| 引物混合液 | 2 | 2 | 2 |
| 样本RNA/标准品 | 5 | - | 5（对应稀释度） |
| 超纯水 | - | 5 | - |
4. 反应程序
| 步骤 | 温度 | 时间 |
| 逆转录 | 50℃ | 30 min |
| 预变性 | 94℃ | 10 min |
| 扩增（40循环） | 94℃ 15 sec → 60℃ 1 min（采集FAM通道信号） |
数据分析
定量检测：以标准品log浓度为横轴、Ct值为纵轴绘制曲线，计算样本浓度。
定性检测：
阳性：Ct ≤ 35，扩增曲线呈典型S型。
阴性：Ct ≥ 40。
可疑结果（35<Ct<40）：需重复检测。
注意事项
分区操作：样本处理、试剂配制、扩增需在不同区域进行，避免交叉污染。
质量控制：每次实验需包含阴/阳性对照。
试剂保存：避光解冻后短暂离心混匀，避免反复冻融。
废弃物处理：实验后使用10%次氯酸或75%乙醇消毒台面及移液器。
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