肠道病毒72型染料法荧光定量RT-PCR试剂盒
商品属性
产品名称 | 肠道病毒72型染料法荧光定量RT-PCR试剂盒 | 英文名称 | Enterovirus 72 Dye-based qRT-PCR Kit |
规格 | 50T | 货号 | PR3250 |
预期用途
本试剂盒基于SYBR Green I 荧光染料法，用于定性检测临床样本（粪便、咽拭子、疱疹液等）中的肠道病毒71型（EV71）RNA，适用于手足口病病原体筛查、流行病学监测及实验室研究。
检测原理
RNA提取：样本中病毒RNA经纯化富集
逆转录（RT）：RNA逆转录为cDNA
荧光定量PCR：
使用EV71特异性引物扩增靶基因（通常为VP1或5'UTR保守区）
SYBR Green I染料嵌入双链DNA，释放荧光信号
实时监测扩增曲线，通过Ct值判定病毒载量
试剂盒组分
| 组分名称 | 规格 | 储存条件 |
| RT-PCR反应液 | 1.2 mL | -20℃避光 |
| EV71特异性引物干粉 | 2管 | -20℃ |
| RT酶混合液 | 100 μL | -20℃ |
| RNase-Free水 | 1 mL | 室温 |
| 阳性对照（EV71 RNA） | 50 μL | -80℃ |
| 阴性对照（DEPC水） | 1 mL | -20℃ |
注：不同批号组分不可混用，避免反复冻融。
适用仪器
主流荧光定量PCR仪：
Bio-Rad CFX96, ABI 7500, Roche LightCycler 480, QuantStudio 系列等
样本要求
| 样本类型 | 采集处理 | 保存条件 |
| 粪便 | 取1 g悬浮于PBS，离心取上清 | ≤24h（4℃）或-80℃冻存 |
| 咽拭子 | 置于病毒保存液，震荡洗脱 | ≤72h（4℃）或-80℃冻存 |
| 疱疹液 | 直接吸取或PBS稀释 | 立即检测或-80℃冻存 |
警告：样本需符合生物安全二级（BSL-2）操作规范。
检测流程
1. RNA提取
推荐使用配套核酸提取试剂盒（如柱提法/磁珠法），提取RNA溶于20-50 μL RNase-Free水。
2. 反应体系配制（20 μL/反应）
| 组分 | 体积 |
| RT-PCR反应液 | 10 μL |
| EV71引物混合物 | 2 μL |
| RT酶混合液 | 1 μL |
| RNA模板 | 5 μL |
| RNase-Free水 | 补至20 μL |
3. PCR程序设置
| 步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 | 信号采集 |
| 逆转录 | 50℃ | 15 min | 1 | 关 |
| 预变性 | 95℃ | 3 min | 1 | 关 |
| 扩增 | 95℃ | 10 sec | 40 | 每循环结束采集 |
| | 60℃ | 30 sec | | |
结果判读
有效性判定：
阳性对照：Ct ≤ 32，扩增曲线呈S型
阴性对照：Ct = 40或无扩增曲线
NTC（无模板对照）：无扩增
样本判定：
阳性：Ct ≤ 38，且扩增曲线指数期明显
可疑：38 < Ct < 40，建议复测
阴性：Ct ≥ 40 或无扩增
性能参数
灵敏度：检测限（LOD）≤ 100 copies/mL
特异性：与柯萨奇病毒（CA16）、埃可病毒等无交叉反应
重复性：CV值 ≤ 5%（同一批内）
注意事项
实验分区操作：试剂配制区、样本处理区、扩增区严格分离
穿戴防护装备：实验服、手套、口罩，避免气溶胶污染
试剂解冻后需涡旋混匀，短暂离心后使用
熔解曲线分析（可选）：扩增结束后运行95℃→60℃→95℃（0.5℃/s），确认单一峰型
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