商品属性
产品名称 | NADP苹果酸脱氢酶（NADPMDH）测试盒 | 产品货号 | BH-96115 |
规格 | 100管/96样、50管/48样 | 产品分类 | 辅酶Ⅰ系列 |
测试方法 | 微量法、紫外分光光度法 | 用途 | 仅供科研实验 |
测定意义与原理
测定意义
NADP-MDH（EC1.1.1.82）是一种依赖NADP+的脱氢酶，主要功能包括：能量代谢调控：参与线粒体苹果酸-天冬氨酸穿梭，维持胞质与线粒体间NADH/NAD+平衡抗氧化防御：调节细胞内NADPH水平，为谷胱甘肽还原酶提供还原力，清除活性氧信号转导：参与激素信号响应、胁迫应激反应，与植物抗逆性密切相关临床应用：血清NADP-MDH活性异常与肝脏疾病、心肌损伤、糖尿病等相关
测定原理
NADP-MDH催化草酰乙酸还原为苹果酸，同时将NADPH氧化为NADP+，反应式如下： 草酰乙酸+NADPH+H+→NADP−MDH苹果酸+NADP+草酰乙酸+NADPH+H+NADP−MDH苹果酸+NADP+ NADPH在340nm处有特征吸收峰，通过监测340nm处吸光度的下降速率，计算NADP-MDH的酶活性。
自备仪器与试剂
必备仪器
紫外分光光度计（波长精度±1nm）或酶标仪（具备340nm检测通道）
台式高速离心机（最大转速≥12000g）
恒温水浴锅（控温精度±0.5℃）
可调式移液器（0.5-10μL、10-100μL、100-1000μL）
超声破碎仪（用于细菌/细胞样本处理）
必备耗材
1mL石英比色皿（光径1cm）或96孔紫外板
离心管（1.5mL、10mL）
一次性吸头（无菌无酶）
研钵/组织匀浆器（冰浴专用）
自备试剂
蒸馏水/去离子水
生理盐水（用于样本稀释）
样本前处理方法
组织样本（动植物）新鲜样本取材后立即放入液氮速冻，-80℃保存；避免样本反复冻融称取0.05-0.1g组织，按1:5-10（W/V）比例加入预冷的提取液冰浴匀浆（转速1000-1500rpm，时间5-10min）转移至离心管，8000g 4℃离心10min，取上清液置冰上待测若酶活性过高，可用提取液稀释后测定（建议稀释倍数1-5倍）
细菌/细胞样本收集对数生长期细菌（OD600=0.6-0.8）或培养细胞（密度1×10^6/mL）8000g 4℃离心5min，弃上清，用生理盐水洗涤2次按500万细菌/细胞加入1mL提取液的比例重悬冰浴超声破碎（功率20%，超声3s，间隔10s，重复30次）12000g 4℃离心10min，取上清液置冰上待测
血清/血浆/尿液样本血清样本：血液凝固后3000g 4℃离心10min，取上清血浆样本：加入抗凝剂后3000g 4℃离心10min，取上清尿液样本：直接取上清，若浑浊需3000g离心5min后取上清以上样本可直接检测，无需提取处理
测定操作步骤
紫外分光光度法操作流程
试剂准备：
从-20℃取出试剂，室温平衡30min，避免阳光直射
试剂一：提取液，无需配制直接使用
试剂二：NADPH溶液，使用前用蒸馏水稀释10倍
试剂三：草酰乙酸溶液，使用前用NaOH溶液调节pH至7.5
空白管校正：
取1mL石英比色皿，依次加入：提取液970μL + 稀释后NADPH溶液10μL + 蒸馏水20μL
37℃预温育5min，记录340nm处初始吸光度A0
样本测定：
另取比色皿，依次加入：提取液950μL + 稀释后NADPH溶液10μL + 样本20μL
37℃预温育5min，加入草酰乙酸溶液20μL立即混匀
连续记录340nm处吸光度变化，分别读取0min（A1）和1min（A2）时的吸光度值
微量法（酶标仪）操作流程96孔板每孔加入：提取液95μL + 稀释后NADPH溶液1μL + 样本2μL37℃预温育5min，加入草酰乙酸溶液2μL立即混匀酶标仪设置动力学模式，340nm处连续读取10个循环（每6s读取1次）计算吸光度下降速率（ΔA/min）
酶活力计算方法
单位定义
U/mL：每mL样本每分钟氧化1nmol NADPH的酶量
U/mgprot：每mg组织蛋白每分钟氧化1nmol NADPH的酶量
U/g鲜重：每g组织鲜重每分钟氧化1nmol NADPH的酶量
U/10⁴cell：每1万个细胞每分钟氧化1nmol NADPH的酶量
计算公式
NADP−MDH活性=ΔA×V反总×V样总ε×d×V样测×T×CNADP−MDH活性=ε×d×V样测×T×CΔA×V反总×V样总
ΔA：吸光度变化值（A1 - A2）
V反总：反应体系总体积（1.0mL）
V样总：样本提取液总体积（mL）
ε：NADPH摩尔消光系数（6.22×10³ L/(mol·cm)）
d：比色皿光径（1cm）
V样测：测定时加入的样本体积（0.02mL）
T：反应时间（1min）
C：样本浓度（蛋白浓度mg/mL、组织鲜重g/mL、细胞数10⁴/mL）
简化公式
血清/血浆样本：NADP-MDH（U/mL）= 6430 × ΔA
组织样本（蛋白浓度）：NADP-MDH（U/mgprot）= 6430 × ΔA ÷ Cpr
组织样本（鲜重）：NADP-MDH（U/g鲜重）= 6430 × ΔA ÷ W
细胞/细菌样本：NADP-MDH（U/10⁴cell）= 13 × ΔA
注意事项
样本处理：
样本需新鲜制备，避免反复冻融；若无法立即检测，-80℃可保存1个月
组织匀浆需在冰浴中进行，避免酶失活
超声破碎时注意控制功率与时间，避免样本过热
试剂使用：
试剂二（NADPH）对光敏感，配制后需避光保存
试剂三（草酰乙酸）需现配现用，避免分解
不同批号试剂禁止混用，避免影响检测结果
测定过程：
若ΔA值大于0.5，建议将样本稀释后重新测定
反应温度需严格控制在37℃（哺乳动物样本）或25℃（植物样本）
测定前需用蒸馏水校正分光光度计零点
质量控制：
每次实验需设置空白对照与阳性对照
若结果偏差较大，需检查样本处理过程与试剂配制是否正确
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关键字： NADP苹果酸脱氢酶;NADPMDH;测试盒;
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