线粒体苹果酸脱氢酶（MDHm）测试盒

线粒体苹果酸脱氢酶（MDHm）测试盒

测定意义与原理

测定意义

MDH（EC1.1.1.37）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，线粒体中MDH是TCA循环的关键酶之一，催化苹果酸形成草酰乙酸；相反，胞浆中MDH催化草酰乙酸形成苹果酸。因此，MDH在细胞多种生理活动中扮演着重要的角色，包括线粒体的能量代谢、苹果酸-天冬氨酸穿梭系统、活性氧代谢和抗病性等。

根据不同的辅酶特异性，MDH分为NAD-依赖的MDH和NADP-依赖的MDH，细菌中通常只含有NAD-MDH，在真核细胞中，NAD-MDH分布于细胞质和线粒体中。

测定原理

MDHm催化NADH还原草酰乙酸生成苹果酸，导致340nm处光吸收下降。通过测定340nm处吸光度的变化，计算MDHm活性。反应式如下： 草酰乙酸+NADH→MDHm苹果酸+NAD+草酰乙酸+NADHMDHm苹果酸+NAD+

试剂盒组成

紫外分光光度法/微量法试剂盒

组分 规格 作用说明

试剂一 100mL×1瓶 含提取液，用于提取样本中的MDHm

试剂二 20mL×1瓶 含NADH溶液，反应底物

试剂三 1.5mL×1支 含草酰乙酸溶液，反应底物

试剂四 25mL×1瓶 含缓冲液，用于配制工作液

试剂五 粉剂×1瓶 含稳定剂，用于稳定反应体系

ELISA法试剂盒

组分 规格 作用说明

包被板 96孔×1块 预包被抗MDHm单克隆抗体

酶标抗体 液体6mL×1瓶 含HRP标记抗MDHm抗体

标准品 液体1mL×6管 含0、2、4、8、16、32U/L MDHm标准品

样本稀释液 10mL×1瓶 用于稀释样本和标准品

显色剂A液 6mL×1瓶 含过氧化氢溶液

显色剂B液 6mL×1瓶 含TMB溶液

终止液 6mL×1瓶 含硫酸溶液

20倍浓缩洗涤液 20mL×1瓶 用于洗涤酶标板

自备仪器与试剂

必备仪器

紫外分光光度法：紫外分光光度计、1mL石英比色皿

微量法：酶标仪（340nm检测通道）、96孔板

ELISA法：酶标仪（450nm检测通道）、96孔板、37℃恒温箱、洗板机

通用：台式离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水

必备耗材

离心管（1.5mL/10mL）、一次性吸头、研钵/组织匀浆器

自备试剂：蒸馏水/去离子水、生理盐水、三氯乙酸

样本前处理方法

动植物组织样本取样：准确称取0.1g组织，用生理盐水洗净表面杂质，用滤纸吸干匀浆：加入1mL试剂一和10μL试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆低速离心：600g，4℃离心5min，弃沉淀，保留上清液高速离心：11000g，4℃离心10min，弃上清液，沉淀即为线粒体线粒体裂解：沉淀中加入200μL试剂二和2μL试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20%或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）检测：裂解液用于MDHm酶活性测定

细胞样本收集：收集500万细胞到离心管内，离心后弃上清破碎：加入1mL试剂一和10μL试剂三，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20%或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）离心：11000g，4℃离心10min，弃上清液，沉淀即为线粒体线粒体裂解：沉淀中加入200μL试剂二和2μL试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20%或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）检测：裂解液用于MDHm酶活性测定

血清/血浆样本

血清/血浆样本可直接检测；若浓度过高，用提取液稀释10-20倍

测定操作步骤

紫外分光光度法/微量法操作仪器预热：分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零工作液配制：临用前将试剂五加入试剂四，混合溶解，制备工作液样本测定：

取10μL样本、200μL工作液和15μL试剂六，混匀后立即记录340nm处20s时的吸光值A1和1min20s后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2

同时设置空白对照，用蒸馏水替代样本，同样操作记录吸光值变化标准曲线绘制：将MDHm标准品稀释成0、10、20、30、40、50U/L系列浓度，同样处理，测定1min内吸光值变化，绘制标准曲线

ELISA法操作试剂准备：将试剂盒从冷藏环境中取出，室温平衡15-30分钟；将20×洗涤缓冲液用蒸馏水20倍稀释后备用加样：

从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃

设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加温育：除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入HRP标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min洗涤：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）显色：每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min终止：每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值结果计算：绘制标准曲线，按曲线方程计算样本浓度

结果计算方法

单位定义

U/mg prot：每毫克组织蛋白每分钟消耗1nmol NADH的酶量

U/g 鲜重：每克鲜重样本每分钟消耗1nmol NADH的酶量

U/L：每升样本每分钟消耗1nmol NADH的酶量

紫外分光光度法/微量法计算公式

MDHm活性(U/mg prot)=(ΔA样本−ΔA空白)×V总Cpr×V样×ε×d×T×109MDHm活性(U/mg prot)=Cpr×V样×ε×d×T(ΔA样本−ΔA空白)×V总×109

ΔA样本：样本管吸光度变化值

ΔA空白：空白管吸光度变化值

V总：反应体系总体积（L）

Cpr：样本蛋白浓度（mg/mL）

V样：样本体积（L）

ε：NADH摩尔消光系数（6.22×10³ L/mol/cm）

d：比色皿光径（cm）

T：反应时间（min）

ELISA法计算公式

MDHm含量(U/L)=样本OD值−空白OD值标准品OD值−空白OD值×标准品浓度×稀释倍数MDHm含量(U/L)=标准品OD值−空白OD值样本OD值−空白OD值×标准品浓度×稀释倍数

性能指标

指标 紫外分光光度法/微量法 ELISA法

线性范围 0~50U/L 0~32U/L

最低检测限 ≤0.1U/L ≤0.1U/L

回收率 90%~110% 90%~110%

批内精密度 CV≤5.0% CV≤5.0%

批间精密度 CV≤8.0% CV≤8.0%

稳定性 2-8℃保存6-12个月 2-8℃保存6-12个月

注意事项

样本处理：

样本需新鲜制备，避免MDHm失活；-20℃可保存3个月

匀浆过程需在冰浴中进行，避免酶失活

液体样本需避免溶血和细菌污染

试剂使用：

工作液临用前配制，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融

ELISA法试剂需避免反复冻融，用后立即放回2-8℃保存

不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线

测定过程：

紫外分光光度法/微量法反应温度需严格控制在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）

ELISA法需严格控制温育时间和温度，避免影响显色反应

若吸光度值超出线性范围，需稀释样本后重新测定

质量控制：

每次实验需设置空白对照和质控样本

定期校准仪器，确保检测结果准确性

若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确

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