商品属性
产品名称 | 6磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PDH）/葡萄糖6磷酸脱氢酶测试盒 | 产品货号 | BH-961118 |
规格 | 100管/96样、50管/48样 | 产品分类 | 辅酶Ⅱ系列 |
测试方法 | 微量法、紫外分光光度法 | 用途 | 仅供科研实验 |
测定意义与原理
测定意义
6磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PDH，EC1.1.1.49）是磷酸戊糖途径（PPP）的关键限速酶，主要功能包括：能量代谢：催化葡萄糖-6-磷酸氧化生成6-磷酸葡萄糖酸内酯，同时生成NADPH抗氧化防御：NADPH是谷胱甘肽还原酶、硫氧还蛋白还原酶的辅酶，维持细胞氧化还原稳态临床诊断：G6PDH缺乏是最常见的遗传性酶病，引起新生儿黄疸、溶血性贫血等疾病关联：G6PDH活性异常与肿瘤、糖尿病、心血管疾病、神经退行性疾病等相关工业应用：用于啤酒酿造、生物燃料生产等领域
测定原理
G6PDH催化葡萄糖-6-磷酸（G-6-P）脱氢生成6-磷酸葡萄糖酸内酯，同时将NADP+还原为NADPH： G-6-P+NADP+→G6PDH6-磷酸葡萄糖酸内酯+NADPH+H+G-6-P+NADP+G6PDH6-磷酸葡萄糖酸内酯+NADPH+H+ NADPH在340nm处有特征吸收峰，通过监测吸光度增加速率计算G6PDH活性。
自备仪器与试剂
必备仪器
紫外分光光度计/酶标仪（340nm检测通道）
台式高速离心机（≥12000rpm）
恒温水浴锅（控温精度±0.5℃）
可调式移液器（0.5-10μL、10-100μL、100-1000μL）
超声破碎仪（用于细胞/细菌样本）
必备耗材
1mL石英比色皿/微量石英比色皿/96孔板
离心管（1.5mL、10mL）
一次性无菌吸头
研钵/组织匀浆器（冰浴专用）
自备试剂
蒸馏水/去离子水
生理盐水（用于样本稀释）
液氮（用于样本速冻保存）
样本前处理方法
植物/动物组织样本新鲜样本取材后立即液氮速冻，-80℃保存；避免反复冻融称取0.1g组织，按1:5-10（W/V）比例加入预冷提取液冰浴匀浆（转速1000-1500rpm，时间5-10min）12000rpm 4℃离心20min，取上清液置冰上待测；若活性过高可稀释1-5倍
细胞/细菌样本收集对数生长期细胞（密度1×10^6/mL）或细菌（OD600=0.6-0.8）8000g 4℃离心5min弃上清，用生理盐水洗涤2次按500万细胞/细菌加入1mL提取液的比例重悬冰浴超声破碎（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）10000rpm 4℃离心10min，取上清液置冰上待测
血清/血浆/红细胞样本血清样本：血液凝固后3000g 4℃离心10min，取上清血浆样本：加入抗凝剂后3000g 4℃离心10min，取上清红细胞样本：取抗凝血3000g离心5min，弃上清，用生理盐水洗涤3次，按1:10比例加入蒸馏水溶血以上样本可直接检测，无需提取处理；活性过高时可用生理盐水稀释
测定操作步骤
紫外分光光度法操作
试剂准备：
试剂一：反应缓冲液，直接使用
试剂二：NADP+溶液，使用前用蒸馏水稀释10倍
试剂三：葡萄糖-6-磷酸溶液，现配现用，-20℃可保存1周
试剂四：提取液，直接使用
预温育：
取比色皿，依次加入：试剂一920μL + 稀释后NADP+溶液20μL + 样本40μL
37℃预温育5min，记录340nm处初始吸光度A1
反应启动：
加入底物溶液20μL，立即混匀，开始计时
分别记录1min（A2）、2min（A3）时的吸光度值
计算ΔA：ΔA = (A2 - A1) + (A3 - A2)
微量法（酶标仪）操作流程96孔板每孔加入：试剂一92μL + 稀释后NADP+溶液2μL + 样本4μL37℃预温育5min，加入底物溶液2μL立即混匀设置动力学模式，340nm处连续读取10个循环（每1min读取1次）计算吸光度增加速率（ΔA/min）
酶活力计算方法
单位定义
U/g鲜重：每g组织鲜重每分钟生成1μmol NADPH的酶量
U/mL：每mL液体样本每分钟生成1μmol NADPH的酶量
U/mgprot：每mg蛋白每分钟生成1μmol NADPH的酶量
U/10⁶cell：每100万个细胞每分钟生成1μmol NADPH的酶量
计算公式
G6PDH活性(U/mgprot)=ΔA×V反总×106ε×d×Cpr×V样×TG6PDH活性(U/mgprot)=ε×d×Cpr×V样×TΔA×V反总×106
ΔA：吸光度变化值（A3 - A1）
V反总：反应体系总体积（1.0mL）
ε：NADPH摩尔消光系数（6.22×10³ L/(mol·cm)）
d：比色皿光径（1cm）
Cpr：样本蛋白浓度（mg/mL）
V样：测定时加入的样本体积（0.04mL）
T：反应时间（2min）
简化公式
组织样本（蛋白浓度）：G6PDH（U/mgprot）= 20.1 × ΔA ÷ Cpr
组织样本（鲜重）：G6PDH（U/g鲜重）= 20.1 × ΔA ÷ W
液体样本：G6PDH（U/mL）= 20.1 × ΔA
细胞/细菌样本：G6PDH（U/10⁶cell）= 0.000201 × ΔA ÷ N
注意事项
样本处理：
G6PDH对温度敏感，所有操作需在冰浴中进行
样本需新鲜制备，-80℃保存不超过1个月
避免样本接触金属离子，可用EDTA螯合
红细胞样本溶血后需立即检测，避免酶失活
试剂使用：
NADP+溶液对光敏感，配制后需避光保存
葡萄糖-6-磷酸溶液需现配现用，避免降解
不同批号试剂不能混用，需重新测定标准曲线
测定过程：
反应温度需严格控制在37℃（哺乳动物样本）或25℃（植物样本）
若ΔA值超出标准曲线范围，需调整稀释倍数重新测定
每个样本需设置3个平行孔，取平均值计算
质量控制：
每次实验设置空白对照和阳性对照
定期校准分光光度计/酶标仪，确保波长准确性
若结果偏差较大，需检查试剂是否变质、样本处理是否正确
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关键字： 6磷酸葡萄糖脱氢酶;G6PDH;测试盒;
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