葡萄糖6磷酸(6PG)测试盒
测定意义与原理
测定意义
6PG（葡萄糖-6-磷酸）是糖酵解和磷酸戊糖途径的中间产物，广泛存在于动植物体和微生物中，其含量测定具有重要意义：临床诊断：诊断和监测遗传性葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症、溶血性贫血、神经肌肉疾病等疾病监测：评估细胞能量代谢状态、组织损伤程度和治疗效果生物学研究：了解细胞内糖酵解途径、磷酸戊糖途径和细胞增殖机制药物研发：筛选抗癌药物、神经保护药物等植物学研究：研究植物光合作用、碳代谢途径、抗逆性机制
测定原理
6-磷酸葡萄糖脱氢酶可催化6PG和NADP+生成6-磷酸葡萄糖酸和NADPH，NADPH在1-mPMS的作用下使WST-8显橙黄色，在450nm下测定吸光值。反应式如下： 6PG+NADP+→6-磷酸葡萄糖脱氢酶6-磷酸葡萄糖酸+NADPH6PG+NADP+6-磷酸葡萄糖脱氢酶6-磷酸葡萄糖酸+NADPH NADPH+WST-8+1-mPMS→橙黄色化合物NADPH+WST-8+1-mPMS→橙黄色化合物
试剂盒组成
分光光度法/微量法试剂盒
组分 规格 作用说明
提取液 液体60mL×1瓶 用于提取样本中的6PG
试剂一 液体45mL×1瓶 含反应缓冲液，用于提供适宜的反应pH环境
试剂二 粉剂×1瓶 含NADP+溶液，反应底物
试剂三 粉剂×1瓶 含WST-8溶液，显色剂
标准品 1mL×1支 含6PG标准液，用于建立标准曲线
ELISA法试剂盒
组分 规格 作用说明
包被板 96孔×1块 预包被抗6PG单克隆抗体
酶标抗体 液体6mL×1瓶 含HRP标记抗6PG抗体
标准品 液体1mL×6管 含0.1-10ng/mL 6PG标准品
样本稀释液 10mL×1瓶 用于稀释样本和标准品
显色剂A液 6mL×1瓶 含过氧化氢溶液
显色剂B液 6mL×1瓶 含TMB溶液
终止液 6mL×1瓶 含硫酸溶液
20倍浓缩洗涤液 20mL×1瓶 用于洗涤酶标板
自备仪器与试剂
必备仪器
分光光度法/微量法：紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、恒温水浴锅、可调式移液器、1mL石英比色皿/96孔板、研钵、电子天平
ELISA法：酶标仪（450nm检测通道）、96孔板、37℃恒温箱、洗板机、可调式移液器、台式离心机
必备耗材
离心管（1.5mL/10mL）、一次性吸头、研钵/组织匀浆器、超声破碎仪
自备试剂：蒸馏水/去离子水、生理盐水
样本前处理方法
动植物组织样本取样：按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆离心：8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测
细胞/微生物样本收集：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清破碎：按照细菌或细胞数量（10⁴个）:提取液体积(mL)为500~1000:1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20%或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）离心：8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测
血清/血浆样本
血清(浆)样品：直接检测
测定操作步骤
分光光度法/微量法操作仪器预热：分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长到450nm，蒸馏水调零试剂配制：
试剂二：临用前加入1.5mL蒸馏水充分溶解备用
试剂三：临用前加入1.5mL蒸馏水充分溶解备用样本测定：
试剂名称(μL) 空白管 测定管
蒸馏水/样本 100 100
试剂一 700 700
试剂二 100 100
试剂三 100 100
混匀后立即记录450nm处反应5min时的吸光值A1和10min时的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1标准曲线绘制：将6PG标准品稀释成0、10、20、30、40、50U/L系列浓度，同样处理，测定10min内吸光度变化，绘制标准曲线
ELISA法操作试剂准备：将试剂盒从冷藏环境中取出，室温平衡15-30分钟；将20×洗涤缓冲液用蒸馏水20倍稀释后备用加样：
从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃
设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加温育：除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入HRP标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min洗涤：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）显色：每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min终止：每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值结果计算：绘制标准曲线，按曲线方程计算样本浓度
结果计算方法
单位定义
nmol/g 鲜重：每克组织中6PG的含量
nmol/mg prot：每毫克组织蛋白中6PG的含量
nmol/L：每升样本中6PG的含量
分光光度法/微量法计算公式
6PG含量(nmol/g 鲜重)=C×V总W6PG含量(nmol/g 鲜重)=WC×V总 6PG含量(nmol/mg prot)=C×V总Cpr6PG含量(nmol/mg prot)=CprC×V总 6PG含量(nmol/L)=C×稀释倍数6PG含量(nmol/L)=C×稀释倍数
C：根据样本吸光度值从标准曲线中查得的6PG浓度（nmol/L）
V总：样本提取液总体积（L）
W：样本质量（g）
Cpr：样本蛋白浓度（mg/mL）
ELISA法计算公式
6PG含量(ng/mL)=样本OD值−空白OD值标准品OD值−空白OD值×标准品浓度×稀释倍数6PG含量(ng/mL)=标准品OD值−空白OD值样本OD值−空白OD值×标准品浓度×稀释倍数
性能指标
指标 分光光度法/微量法 ELISA法
线性范围 0~50U/L 0.1-10ng/mL
最低检测限 ≤0.1U/L ≤0.05ng/mL
回收率 90%~110% 90%~110%
批内精密度 CV≤2.2% CV≤3.8%
批间精密度 CV≤5.0% CV≤8.5%
稳定性 2-8℃保存6-12个月 2-8℃保存6-12个月
注意事项
样本处理：
样本需新鲜制备，避免6PG失活；-20℃可保存3个月
组织样本需冰浴匀浆，避免酶失活
液体样本需避免溶血和细菌污染
试剂使用：
试剂需临用前配制，避免氧化失效
不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线
标准品需4℃保存，避免反复冻融
测定过程：
反应温度需严格控制在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）
加入样品启动反应后3秒内即刻比色测定
若吸光度值超出线性范围，需稀释样本后重新测定
质量控制：
每次实验需设置空白对照和质控样本
定期校准仪器，确保检测结果准确性
若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确
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