商品属性
产品名称 | 总巯基测试盒 | 产品货号 | BH-961175 |
规格 | 100管/48样、50管/24样 | 产品分类 | 氧化与抗氧化系列 |
测试方法 | 微量法、可见分光光度法 | 用途 | 仅供科研实验 |
测定意义与原理
测定意义
总巯基（-SH）是生物体内重要的功能性基团，具有多种生理和病理意义：蛋白质结构与功能：参与蛋白质折叠和稳定，影响酶活性和信号传导抗氧化作用：谷胱甘肽等巯基化合物是重要的内源性抗氧化剂，清除自由基氧化应激评估：总巯基含量下降是氧化损伤的敏感指标疾病诊断：与心血管疾病、癌症、神经退行性疾病等密切相关食品品质控制：面粉、肉类、乳制品等的新鲜度和加工质量指标
测定原理
采用Ellman法（DTNB显色法），反应原理如下： R-SH+DTNB→R-S-S-TNB+TNB−R-SH+DTNB→R-S-S-TNB+TNB− 巯基基团与5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)（DTNB）反应，生成黄色的2-硝基-5-硫代苯甲酸（TNB⁻），在412nm处有最大吸收峰，吸光度与总巯基含量成正比。
试剂盒组成
组分 规格 作用说明
试剂A 液体100mL×1瓶 含0.1mol/L磷酸缓冲液，pH8.0，提供反应环境
试剂B 液体20mL×1瓶 含10mmol/L DTNB溶液，显色剂，与巯基反应产生黄色化合物
试剂C 粉剂×1支 含2mmol/L谷胱甘肽（GSH）标准品，用于建立标准曲线
提取液 液体100mL×1瓶 含5%三氯乙酸（TCA），用于蛋白质沉淀和巯基提取
自备仪器与试剂
必备仪器
分光光度法：可见分光光度计（412nm检测通道）、1mL玻璃比色皿
微量法：酶标仪（412nm检测通道）、96孔板
通用：低温离心机（≥11000g）、恒温水浴锅、可调式移液器、漩涡混匀器
必备耗材
离心管（1.5mL/10mL）、一次性吸头、研钵/组织匀浆器
自备试剂：蒸馏水/去离子水、生理盐水、抗凝剂（肝素/柠檬酸钠）
样本前处理方法
动植物组织样本取新鲜组织约0.1g，用生理盐水冲洗干净，滤纸吸干水分加入1mL提取液，冰浴匀浆，室温静置10min11000g 4℃离心10min，取上清液用试剂A稀释1-10倍后测定
细胞样本收集500万对数生长期细胞，8000g 4℃离心5min弃上清加入1mL提取液，冰浴超声波破碎（功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次）11000g 4℃离心10min，取上清液用试剂A稀释1-10倍后测定
血清/血浆样本血清样本：血液凝固后3000g 4℃离心10min，取上清直接测定或-80℃保存血浆样本：用肝素/柠檬酸钠抗凝，5000g 4℃离心10min，取上清直接测定样本避免溶血，溶血会导致结果偏高
食品样本面粉：取约0.1g面粉，加入1mL提取液，振荡混匀，室温静置30min肉类/乳制品：取约0.5g样本，加入2mL提取液，冰浴匀浆11000g 4℃离心10min，取上清液用试剂A稀释1-10倍后测定
测定操作步骤
标准曲线建立将2mmol/L谷胱甘肽标准品用试剂A稀释成0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0mmol/L系列浓度取比色管/96孔板，加入标准品溶液0.2mL + 试剂B 0.05mL，混匀37℃水浴反应10min，412nm波长下测定吸光度以巯基浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线
样本测定工作液配制：取试剂B 1mL + 试剂A 4mL，混匀即为工作液（现配现用）样本处理：取样本0.2mL + 工作液0.05mL，混匀反应与测定：37℃水浴反应10min，412nm波长下测定吸光度空白对照：取试剂A 0.2mL + 工作液0.05mL，同样处理
结果计算方法
单位定义
μmol/g 鲜重：每克组织鲜重中总巯基的含量
μmol/L：每毫升血清/血浆中总巯基的含量
μmol/mgprot：每毫克蛋白中总巯基的含量
计算公式
总巯基含量(μmol/g鲜重)=(A样−A空)×C标×V总(A标−A空标)×W总巯基含量(μmol/g鲜重)=(A标−A空标)×W(A样−A空)×C标×V总
A样-A空：样本扣除空白后的吸光度值
C标：标准品浓度（μmol/L）
V总：样本提取液总体积（mL）
A标-A空标：标准品扣除空白后的吸光度值
W：样本质量（g）
简化公式
按体积计算：总巯基（μmol/L）= C标 × (A样-A空)/(A标-A空标)
按鲜重计算：总巯基（μmol/g鲜重）= C标 × (A样-A空)/(A标-A空标) × V总/W
性能指标
指标 要求
线性范围 0~2μmol/L谷胱甘肽当量，线性相关系数r≥0.995
最低检测限 ≤0.05μmol/L
回收率 90%~110%
批内精密度 CV≤5.0%
批间精密度 CV≤8.0%
稳定性 2-8℃保存12个月，活性保留≥90%
注意事项
样本处理：
样本需新鲜制备，避免巯基氧化；-80℃可保存1个月
提取液含三氯乙酸，需在通风橱中操作，避免接触皮肤和眼睛
样本中不能添加巯基乙醇、DTT等还原剂，以免干扰测定
试剂使用：
DTNB溶液对光敏感，需避光保存，现配现用
标准品需现配现用，避免氧化失效
不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线
测定过程：
反应温度需严格控制在37℃，反应时间10min
若吸光度值超出线性范围，需稀释样本后重新测定
每个样本需设置至少3个平行实验，结果取平均值
质量控制：
每次实验需设置空白对照和质控样本
定期校准仪器，确保检测结果准确性
若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确
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