商品属性
产品名称 | 超氧阴离子清除能力测试盒 | 产品货号 | BH-961179 |
规格 | 100管/96样、50管/48样 | 产品分类 | 氧化与抗氧化系列 |
测试方法 | 微量法、可见分光光度法 | 用途 | 仅供科研实验 |
测定意义与原理
测定意义
超氧阴离子自由基（O₂·⁻）是体内最早产生的活性氧自由基，在氧化应激和信号传导中发挥重要作用：疾病诊断：超氧阴离子清除能力下降与心血管疾病、肿瘤、神经退行性疾病等密切相关抗氧化研究：评价天然产物、药物、食品添加剂的抗氧化活性环境监测：评估污染物对生物体氧化损伤的影响细胞生物学：研究细胞凋亡、信号传导和氧化应激机制临床研究：评估抗氧化治疗的疗效和机制
测定原理
采用NBT比色法测定超氧阴离子清除能力： NADH+PMS→反应O2⋅−+NAD+NADH+PMS反应O2⋅−+NAD+ O2⋅−+NBT→反应蓝色甲臜O2⋅−+NBT反应蓝色甲臜 超氧阴离子与硝基四氮唑蓝（NBT）反应生成蓝色甲臜，在560nm处有特征吸收峰，吸光度与超氧阴离子含量成正比。通过测定样本加入后吸光度的变化，计算超氧阴离子清除率。
试剂盒组成
组分 规格 作用说明
试剂一 液体40mL×1瓶 含NADH溶液，作为超氧阴离子生成的底物
试剂二 液体1mL×1瓶 含PMS溶液，作为催化剂，加速超氧阴离子的生成
试剂三 液体100mL×1瓶 含NBT溶液，作为显色剂，与超氧阴离子反应产生蓝色甲臜
试剂四 液体100mL×1瓶 含磷酸盐缓冲液，作为反应缓冲液
提取液 液体100mL×1瓶 含pH7.4磷酸盐缓冲液，用于动植物组织和细胞样本提取
自备仪器与试剂
必备仪器
可见分光光度计/酶标仪（560nm检测通道）
低温高速离心机（≥12000g）
可调式移液器（0.5-10μL、10-100μL、100-1000μL）
恒温水浴锅（控温精度±0.5℃）
研钵/组织匀浆器
必备耗材
1mL玻璃比色皿/96孔板
离心管（1.5mL、10mL）
一次性无菌吸头
自备试剂
蒸馏水/去离子水
生理盐水
抗凝剂（肝素/柠檬酸钠，仅用于血浆样本）
样本前处理方法
动植物组织样本取新鲜组织约0.1g，用生理盐水冲洗干净，滤纸吸干水分加入1mL提取液，冰浴匀浆，12000rpm 4℃离心20min取上清液置冰上待测，若抗氧化能力过强，可用提取液稀释1-5倍后测定
细胞样本收集500万对数生长期细胞，8000g 4℃离心5min弃上清加入1mL提取液，冰浴超声波破碎（功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次）12000rpm 4℃离心20min，取上清液置冰上待测
血清/血浆样本血清样本：血液凝固后3000g 4℃离心10min，取上清直接测定或-80℃保存血浆样本：用肝素/柠檬酸钠抗凝，5000g 4℃离心10min，取上清直接测定样本避免溶血，溶血会导致结果偏高
食品/化妆品样本固态样本：取约0.1g样本，加入1mL提取液，冰浴匀浆液态样本：取约0.5mL样本，加入0.5mL提取液，振荡混匀12000rpm 4℃离心20min，取上清液置冰上待测
测定操作步骤
标准曲线建立将超氧阴离子标准品用提取液稀释成0、10、20、30、40、50μmol/L系列浓度取比色管/96孔板，加入标准品溶液0.1mL + 试剂一0.1mL + 试剂二0.1mL + 试剂三0.1mL + 试剂四0.6mL，混匀37℃水浴反应10min，560nm波长下测定吸光度以超氧阴离子浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线
样本测定工作液配制：取试剂一1mL + 试剂二0.5mL + 试剂三10mL + 试剂四88.5mL，混匀即为工作液（现配现用）样本处理：取样本0.1mL + 工作液1.9mL，混匀反应与测定：37℃水浴反应10min，560nm波长下测定吸光度空白对照：取试剂四0.1mL + 工作液1.9mL，同样处理
结果计算方法
单位定义
μmol/L：每毫升样本中超氧阴离子的含量
μmol/g鲜重：每克组织中超氧阴离子的含量
清除率%：样本清除超氧阴离子的百分比
计算公式
超氧阴离子清除率(%)=A空白−A样A空白×100%超氧阴离子清除率(%)=A空白A空白−A样×100% 超氧阴离子含量(μmol/g鲜重)=(A样−A空白)×C标(A标−A空白标)×V总W超氧阴离子含量(μmol/g鲜重)=(A标−A空白标)(A样−A空白)×C标×WV总
A样-A空白：样本扣除空白后的吸光度值
C标：标准品浓度（μmol/L）
V总：样本提取液总体积（mL）
A标-A空白标：标准品扣除空白后的吸光度值
W：样本质量（g）
性能指标
指标 要求
线性范围 0~50μmol/L，线性相关系数r≥0.995
最低检测限 ≤1μmol/L
回收率 90%~110%
批内精密度 CV≤5.0%
批间精密度 CV≤8.0%
稳定性 -20℃保存12个月，活性保留≥90%
注意事项
样本处理：
样本需新鲜制备，避免长时间放置导致超氧阴离子降解；-80℃可保存1个月
匀浆与超声破碎需在冰浴中进行，控制温度在0-4℃
样本需避免氧化，处理过程中尽量减少与空气接触
试剂使用：
试剂三对光敏感，配制后需避光保存，且易挥发，反应时建议密封
标准品需现配现用，避免氧化失效
不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线
测定过程：
反应温度需严格控制在37℃，反应时间10min
若吸光度值超出线性范围，需稀释样本后重新测定
每个样本需设置至少3个平行实验，结果取平均值
质量控制：
每次实验需设置空白对照和质控样本
定期校准仪器，确保检测结果准确性
若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确
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