淀粉脱分支酶（DBE）测试盒

淀粉脱分支酶（DBE）测试盒

测定意义与原理

测定意义

淀粉脱分支酶（DBE, EC3.2.1.41/EC3.2.1.68）包括异淀粉酶和极限糊精酶两种类型，能够专一性地裂解支链淀粉的α-1,6糖苷键，产生线性的葡萄糖链，在调整支链淀粉分子的链长方面有重要的作用。其活性检测具有重要意义：农业研究：研究作物淀粉品质改良、抗逆性机制和肥料效应食品工业：评估食品营养价值、控制食品加工过程和质量生物学研究：了解植物能量代谢途径和碳代谢调控机制基础研究：研究淀粉合成相关基因功能和表达调控

测定原理

3,5-二硝基水杨酸比色法：DBE能够专一性地裂解支链淀粉的α-1,6糖苷键，产生线性的葡萄糖链，在反应体系中添加的3,5-二硝基水杨酸与还原糖反应生成棕红色的氨基化合物，在540nm处有特征吸收峰，其颜色深浅与DBE活性成正比。反应式如下： 支链淀粉→DBE线性葡萄糖链支链淀粉DBE线性葡萄糖链 还原糖+3,5-二硝基水杨酸→沸水浴棕红色氨基化合物还原糖+3,5-二硝基水杨酸沸水浴棕红色氨基化合物

ELISA法：采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验，将DBE与特异性抗体结合，通过酶标二抗检测结合的DBE，根据吸光度值计算DBE含量。

试剂盒组成

3,5-二硝基水杨酸比色法试剂盒

组分 规格 作用说明

提取液 液体60mL×1瓶 用于提取样本中的DBE

试剂二 粉剂×1支 含缓冲液和底物支链淀粉溶液

试剂三 液体20mL×1瓶 含3,5-二硝基水杨酸，显色剂

试剂四 液体25mL×1瓶 含NaOH和酒石酸钾钠，显色辅助剂

标准品 1mL×1支 含葡萄糖标准液，浓度为10mg/mL

ELISA法试剂盒

组分 规格 作用说明

包被板 96孔×1块 预包被抗DBE单克隆抗体

酶标抗体 液体6mL×1瓶 含HRP标记抗DBE抗体

标准品 液体1mL×6管 含0.1-10ng/mL DBE标准品

样本稀释液 10mL×1瓶 用于稀释样本和标准品

显色剂A液 6mL×1瓶 含过氧化氢溶液

显色剂B液 6mL×1瓶 含TMB溶液

终止液 6mL×1瓶 含硫酸溶液

20倍浓缩洗涤液 20mL×1瓶 用于洗涤酶标板

自备仪器与试剂

必备仪器

3,5-二硝基水杨酸比色法：可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、恒温水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿/96孔板、研钵、电子天平

ELISA法：酶标仪（450nm检测通道）、96孔板、37℃恒温箱、洗板机、可调式移液器、台式离心机

必备耗材

离心管（1.5mL/10mL）、一次性吸头、研钵/组织匀浆器、超声破碎仪

自备试剂：蒸馏水/去离子水、生理盐水

样本前处理方法

植物组织样本取样：准确称取0.1g组织，加入1mL提取液，用冰浴匀浆器或研钵匀浆离心：15000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20°C，避免反复冻融

血清/血浆样本采集：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20°C，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻处理：直接检测。

细胞/微生物样本收集：先收集微生物或细胞到离心管内，离心后弃上清破碎：按照微生物或细胞数量（10⁴个）:提取液体积(mL)为500~1000:1的比例（建议500万微生物或细胞加入1mL提取液），超声波破碎微生物或细胞（冰浴，功率20%或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）离心：8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测

测定操作步骤

3,5-二硝基水杨酸比色法操作仪器预热：可见分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长到540nm，蒸馏水调零试剂配制：

试剂二工作液：临用前每支加入6mL提取液，充分混匀后备用；用不完的试剂4℃保存

显色剂工作液：将试剂三、试剂四按1:1比例混合，临用前配制样本测定：

试剂名称(μL) 空白管 测定管

蒸馏水/样本 100 100

试剂二工作液 700 700

混匀后40℃水浴30min，立即加入200μL显色剂工作液，沸水浴5min，冷却后测定540nm处的吸光值A空白和A测定标准曲线绘制：将葡萄糖标准品稀释成0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL系列浓度，同样处理，测定540nm处的吸光值，绘制标准曲线

ELISA法操作试剂准备：将试剂盒从冷藏环境中取出，室温平衡15-30分钟；将20×洗涤缓冲液用蒸馏水20倍稀释后备用加样：

从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃

设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加温育：除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入HRP标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min洗涤：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）显色：每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min终止：每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值结果计算：绘制标准曲线，按曲线方程计算样本浓度

结果计算方法

单位定义

U/g：每克样本每分钟催化裂解1μmol α-1,6糖苷键的酶量

U/mg prot：每毫克组织蛋白每分钟催化裂解1μmol α-1,6糖苷键的酶量

U/10⁴ cell：每1万个细胞每分钟催化裂解1μmol α-1,6糖苷键的酶量

3,5-二硝基水杨酸比色法计算公式

DBE活性(U/g)=(A测定−A空白)(A标准−A空白)×标准品浓度×稀释倍数×V总W×1T×1000180DBE活性(U/g)=(A标准−A空白)(A测定−A空白)×标准品浓度×稀释倍数×WV总×T1×1801000

A测定：样本管吸光度值

A空白：空白管吸光度值

A标准：标准管吸光度值

标准品浓度：通常为10mg/mL

V总：样本提取液总体积（mL）

W：样本质量（g）

T：反应时间（min）

180：葡萄糖分子量

ELISA法计算公式

DBE含量(ng/mL)=样本OD值−空白OD值标准品OD值−空白OD值×标准品浓度×稀释倍数DBE含量(ng/mL)=标准品OD值−空白OD值样本OD值−空白OD值×标准品浓度×稀释倍数

性能指标

指标 3,5-二硝基水杨酸比色法 ELISA法

线性范围 0~1mg/mL 0.1-10ng/mL

最低检测限 ≤0.01mg/mL ≤0.05ng/mL

回收率 90%~110% 90%~110%

批内精密度 CV≤2.0% CV≤3.8%

批间精密度 CV≤5.0% CV≤8.5%

稳定性 2-8℃保存6-12个月 -20℃保存6-12个月

注意事项

样本处理：

样本需新鲜制备，避免DBE失活；-20℃可保存3个月

组织样本需冰浴匀浆，避免酶失活

超声波破碎时需控制功率和时间，避免样本降解

试剂使用：

显色剂工作液需临用前配制，避免氧化失效

不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线

标准品需4℃保存，避免反复冻融

测定过程：

沸水浴时间需严格控制在5min，避免颜色过深

显色后需立即测定，避免颜色褪去

若吸光度值超出线性范围，需稀释样本后重新测定

质量控制：

每次实验需设置空白对照和质控样本

定期校准仪器，确保检测结果准确性

若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确

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