蔗糖合成酶（合成方向 SSⅡ)测试盒
测定意义与原理
测定意义
蔗糖是源(叶片等)光合产物向"库"器官运输的主要形态。 蔗糖合成酶(SucroseSynthase,EC2.4.1.13)是双向反应酶,既可催化蔗糖合成又可催化蔗糖分解,是蔗糖代谢的关键酶之一。 研究其合成方向SS-Ⅱ的活性对于植物蔗糖合成具有重要意义。
测定原理
SS-Ⅱ催化游离果糖与葡萄糖供体UDPG反应生成蔗糖,蔗糖与间苯二酚反应可呈现颜色变化,在480nm下有特征吸收峰,酶活力大小与颜色的深浅成正比。
试剂盒组成
间苯二酚比色法/微量法试剂盒
组分 规格 作用说明
提取液 液体100mL×1瓶 用于提取样本中的SS-Ⅱ
试剂一 液体2.5mL×1瓶,-20℃保存; 含缓冲液和底物UDPG溶液
试剂二 液体10mL×1瓶,4℃保存; 含1000μg/ml蔗糖标准液
试剂三 液体/瓶; 含间苯二酚溶液，显色剂
试剂四 液体25mL×1瓶; 含酸性催化剂溶液
试剂五 液体6mL×1瓶,4℃避光保存; 含反应终止液
自备仪器与试剂
必备仪器
间苯二酚比色法/微量法：可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、恒温水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿/96孔板、研钵、电子天平
必备耗材
离心管（1.5mL/10mL）、一次性吸头、研钵/组织匀浆器、超声破碎仪
自备试剂：蒸馏水/去离子水、生理盐水
样本前处理方法
植物组织样本取样：按照组织质量(g):提取液体积(ml)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1ml提取液),进行冰浴匀浆。离心：8000g,4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
种子样本取样：称取0.1g种子,加入1ml提取液,进行冰浴匀浆。离心：8000g,4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
果实样本取样：称取0.1g果实,加入1ml提取液,进行冰浴匀浆。离心：8000g,4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
细胞/微生物样本收集：先收集微生物或细胞到离心管内,离心后弃上清破碎：按照微生物或细胞数量(10⁴个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万微生物或细胞加入1mL提取液),超声波破碎微生物或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次)离心：8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测
测定操作步骤
间苯二酚比色法/微量法操作仪器预热：可见分光光度计预热30min以上,调节波长至480nm,蒸馏水调零。试剂配制：
显色剂工作液：将试剂三、试剂四按1:1比例混合,临用前配制样本测定：在EP管中加入下列试剂:
试剂名称(μl) 空白管 测定管 标准管
蒸馏水/样本/标准品 100 100 100
试剂一 700 700 700
混匀,25℃准确水浴10min,立即加入200μL显色剂工作液,沸水浴中煮沸10min左右(盖紧,以防止水分散失),冷却后测定480nm处的吸光值A空白、A测定和A标准标准曲线绘制：将蔗糖标准品稀释成0、100、200、400、600、800、1000μg/mL系列浓度,同样处理,测定480nm处的吸光值,绘制标准曲线
结果计算方法
单位定义
U/mg prot：每mg组织蛋白每分钟催化产生1μg蔗糖定义为一个酶活力单位。
U/g FW：每g组织每分钟催化产生1μg蔗糖的酶量定义为一个酶活力单位。
计算公式
SS-Ⅱ活性(U/mg prot)=(A测定管−A对照管)(A标准管−A空白管)×C标准管×V总V1×Cpr×TSS-Ⅱ活性(U/mg prot)=(A标准管−A空白管)(A测定管−A对照管)×V1×Cpr×TC标准管×V总 SS-Ⅱ活性(U/g FW)=(A测定管−A对照管)(A标准管−A空白管)×C标准管×V总V1×W×TSS-Ⅱ活性(U/g FW)=(A标准管−A空白管)(A测定管−A对照管)×V1×W×TC标准管×V总
A测定管：样本管吸光度值
A对照管：对照管吸光度值
A标准管：标准管吸光度值
A空白管：空白管吸光度值
C标准管：标准管浓度,1000μg/ml
V总：样本提取液总体积，1ml
V1：加入反应体系中样本体积，0.01ml
Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml
W：样本鲜重，g
T：反应时间:10min
性能指标
指标 间苯二酚比色法/微量法
线性范围 0~1000μg/mL
最低检测限 ≤10μg/mL
回收率 90%~110%
批内精密度 CV≤2.0%
批间精密度 CV≤5.0%
稳定性 4℃保存6-12个月
注意事项
样本处理：
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
样本需新鲜制备,避免SS-Ⅱ失活；-20℃可保存3个月
组织样本需冰浴匀浆,避免酶失活
超声波破碎时需控制功率和时间,避免样本降解
试剂使用：
显色剂工作液需临用前配制,避免氧化失效
不同批号试剂不能混用,需重新绘制标准曲线
标准品需4℃保存,避免反复冻融
测定过程：
沸水浴时间需严格控制在10min,避免颜色过深
显色后需立即测定,避免颜色褪去
若吸光度值超出线性范围,需稀释样本后重新测定
质量控制：
每次实验需设置空白对照和质控样本
定期校准仪器,确保检测结果准确性
若结果偏差较大,需检查试剂是否变质或样本处理是否正确
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