海藻糖含量测试盒
测定意义与原理
测定意义
海藻糖存在于大量有机体中,包括细菌、藻类、酵母、植物、昆虫和其他无脊椎动物。由于海藻糖具有独特的不同于其他碳水化合物的生物学特性,能在干旱、高温、脱水、冷冻、高渗透压及毒性物质等恶劣环境下保护生物体细胞蛋白质、脂肪、糖类、核酸等组分不受损害。
测定原理
采用蒽酮比色法。具有灵敏度高﹑简便快捷﹑适用于微量样品的测定等优点。反应式如下： 海藻糖+蒽酮→浓硫酸,沸水浴蓝绿色化合物海藻糖+蒽酮浓硫酸,沸水浴蓝绿色化合物
试剂盒组成
蒽酮比色法试剂盒
组分 规格 作用说明
提取液 液体100mL×1瓶 用于提取样本中的海藻糖
试剂一 粉剂×1瓶 含蒽酮，显色剂；临用前加入7.5mL蒸馏水后,缓慢加入42.5mL浓硫酸,不断搅拌,充分溶解,待用;用不完的试剂4℃保存一周
标准品 1mL×1支 含海藻糖标准液
酶标法试剂盒
组分 规格 作用说明
包被板 96孔/48孔 预包被海藻糖单抗
标准品 1mL×1支 含海藻糖标准液，浓度系列为0、20、40、80、160、320ng/mL
酶标二抗 12mL/6mL×1瓶 辣根过氧化物酶标记的海藻糖多抗
底物溶液 12mL/6mL×1瓶 TMB显色液
终止液 12mL/6mL×1瓶 2M H2SO4，终止显色反应
洗涤液 20×25mL/20×15mL×1瓶 含Tween-20的PBS缓冲液
封闭液 1×20mL/1×10mL×1瓶 含BSA的PBS缓冲液，用于封闭非特异性结合
Megazyme酶法试剂盒
组分 规格 作用说明
试剂1 25mL×1瓶 含Buffer (pH 7.0) plus magnesium chloride and sodium azide (0.02% w/v) as a preservative
试剂2 1mL×1瓶 含Trehalase (200 U/mL) in 3.2 M ammonium sulfate (preservative)
试剂3 1mL×1瓶 含Hexokinase plus glucose-6-phosphate dehydrogenase (ca. 2 500 U/mL HK, ca. 1 500 U/mL G6P-DH) in 3.2 M ammonium sulfate (preservative)
试剂4 1mL×1瓶 含ATP (ca. 300 mM) in stabiliser
试剂5 1mL×1瓶 含NADP (ca. 100 mM) in stabiliser
自备仪器与试剂
必备仪器
蒽酮比色法/分光光度法/微量法：可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、恒温水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿/96孔板、研钵、电子天平
酶标法：酶标仪（450nm波长）、精密移液器、恒温水浴箱、洗板机（可选）
Megazyme酶法：可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、恒温水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿/96孔板
必备耗材
离心管（1.5mL/10mL）、一次性吸头、研钵/组织匀浆器、超声破碎仪
自备试剂：蒸馏水/去离子水、生理盐水、浓硫酸(不允许快递)
样本前处理方法
细菌或细胞样本处理：收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照每500万细菌或细胞加入1ML提取液,超声波破碎细菌或细胞(功率20%,超声3秒,间隔10秒,重复30次),室温静置45min,振荡3~5次,冷却后,8000g,常温离心,取上清。
组织样本处理：称取约0.1g样本,常温研碎,加入1mL提取液,室温静置45min,振荡3~5次,冷却后,8000g,常温离心,取上清。
血清(浆)样本处理：吸取约100μL血清(浆),加入1mL提取液,室温静置45min,振荡3~5次,冷却后,8000g,常温离心,取上清。
测定操作步骤
蒽酮比色法操作仪器预热：分光光度计预热30min以上,调节波长至620nm,蒸馏水调零;调节水浴锅至95度。试剂配制：临用前在每瓶试剂一中加入7.5mL蒸馏水后,缓慢加入42.5mL浓硫酸,不断搅拌,充分溶解,待用;用不完的试剂4℃保存一周。样本测定：取0.25ml样本和1ml工作液至EP管中,95度水浴10min(盖紧,防止水分散失),自然冷却至室温,请谨慎操作。若吸光值大于1,请将样本用提取液稀释后再测定,计算公式中乘以相应的稀释倍数。
Megazyme酶法操作试剂准备：将所有试剂平衡至室温；配制工作液：将试剂1、2、3、4、5按比例混合加样：分别设置空白孔、标准孔、样本孔，加入相应溶液孵育：37℃孵育30min，测定340nm处吸光值计算：根据标准曲线计算样本中海藻糖浓度
结果计算方法
单位定义
mg/g FW：每克鲜重样本中含有的海藻糖毫克数
mg/mL：每毫升样本中含有的海藻糖毫克数
ng/mL：每毫升样本中含有的海藻糖纳克数
计算公式
海藻糖含量(mg/g FW)=(A测定−A空白)(A标准−A空白)×C标准×V总W×V1海藻糖含量(mg/g FW)=(A标准−A空白)(A测定−A空白)×W×V1C标准×V总 海藻糖含量(mg/mL)=(A测定−A空白)(A标准−A空白)×C标准×n海藻糖含量(mg/mL)=(A标准−A空白)(A测定−A空白)×C标准×n
A测定：样本管吸光度值
A空白：空白管吸光度值
A标准：标准管吸光度值
C标准：标准管浓度
V总：样本提取液总体积，mL
V1：加入反应体系中样本体积，mL
W：样本鲜重，g
n：样本稀释倍数
性能指标
指标 蒽酮比色法 酶标法 Megazyme酶法
线性范围 0~1mg/mL 20~320ng/mL 0~200μg/mL
最低检测限 ≤0.01mg/mL ≤5ng/mL ≤0.1μg/mL
回收率 99% 95%~105% 90%~110%
批内精密度 CV≤2.0% CV≤3.0% CV≤2.0%
批间精密度 CV≤5.0% CV≤6.0% CV≤5.0%
稳定性 2～8℃存放3个月有效 4℃保存6-12个月 4℃保存6-12个月
注意事项
样本处理：
样本需新鲜制备,避免海藻糖降解；-20℃可保存3个月
组织样本需冰浴匀浆,避免海藻糖降解
超声波破碎时需控制功率和时间,避免样本降解
试剂使用：
工作液需临用前配制,避免氧化失效
不同批号试剂不能混用,需重新绘制标准曲线
标准品需4℃保存,避免反复冻融
浓硫酸具有强腐蚀性,操作时需小心
测定过程：
沸水浴时间需严格控制在10min,避免颜色过深
显色后需立即测定,避免颜色褪去
若吸光度值超出线性范围,需稀释样本后重新测定
质量控制：
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
每次实验需设置空白对照和质控样本
定期校准仪器,确保检测结果准确性
若结果偏差较大,需检查试剂是否变质或样本处理是否正确
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