牛棒杆菌染料法荧光定量PCR试剂盒 新品

牛棒杆菌染料法荧光定量PCR试剂盒

商品属性

产品概述

本试剂盒采用 SYBR Green I 荧光染料法，专用于快速、高灵敏度检测牛棒杆菌（Corynebacterium bovis）DNA。适用于牛奶、组织样本、环境拭子等中的病原体定量检测，兼容常见实时荧光定量PCR仪（如ABI 7500, Bio-Rad CFX, Roche LightCycler等）。

检测原理

特异性引物：针对牛棒杆菌保守基因（如16S rRNA或ropB基因）设计引物。

SYBR Green I 染料：与双链DNA结合发出荧光信号，强度与产物量成正比。

实时监测：通过PCR循环中的荧光积累值（Ct值）定量起始模板浓度。

试剂盒组分

| 组分名称 | 体积/数量 | 主要功能 |

| 2× SYBR Green Master Mix | 1.25 mL | 含DNA聚合酶、dNTPs、缓冲液 |

| 牛棒杆菌引物混合液 | 150 μL | 特异性扩增靶基因 |

| 阳性对照（牛棒杆菌DNA）| 50 μL | 10^4 copies/μL |

| 阴性对照（无核酸水） | 1 mL | 排除污染 |

| DNase/RNase-Free Water | 1.5 mL | 模板稀释 |

操作流程

样本DNA提取

建议使用商用细菌DNA提取试剂盒（如Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit），提取后DNA置于-20℃备用。

PCR反应体系配制（50 μL体系）

| 组分 | 体积 |

| 2× SYBR Green Master Mix | 25 μL |

| 引物混合液 | 2 μL |

| 模板DNA | 5 μL |

| DNase/RNase-Free Water | 18 μL |

注意：每个样本设3个复孔，同时设置阳性/阴性对照。

扩增程序

| 步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 | 采集荧光 |

| 预变性 | 95℃ | 5 min | 1 | 否 |

| 变性 | 95℃ | 15 sec | 40 | 否 |

| 退火/延伸 | 60℃ | 30 sec | 40 | 是 |

| 熔解曲线 | 65℃→95℃ | 每0.5℃升 | 1 | 是 |

数据分析

阈值设定：仪器软件自动或手动调整至指数扩增期荧光信号。

定量标准：

阳性对照Ct值 ≤ 30，阴性对照无扩增。

样本Ct值 < 35且熔解曲线为单峰判为阳性。

定量计算：通过标准曲线（建议使用10^1~10^6 copies/μL梯度稀释阳性对照）计算样本拷贝数。

性能参数

| 指标 | 结果 |

| 检出限（LOD） | 10 copies/反应 |

| 线性范围 | 10^1~10^7 copies/μL |

| 特异性 | 不扩增其他棒杆菌属（如白喉杆菌） |

| 重复性（CV值） | 批内/批间 < 5% |

注意事项

实验分区操作：试剂配制区、样本处理区、PCR扩增区需严格分离。

熔解曲线验证：阳性样本需呈现单一峰值（Tm ≈ 85±1℃），排除引物二聚体干扰。

污染防控：使用UDG酶防污染体系（可选），定期清洁移液器及工作台。

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