miRNA加尾染料法荧光定量PCR试剂盒

基本信息‌

‌中文名称‌：miRNA加尾染料法荧光定量PCR试剂盒

货号：P-PR1432

规格：200反应、300反应、400反应

‌英文名称‌：miRNA Poly(A) Tailing Dye-based Quantitative PCR Kit
作用机制：先通过加尾酶为miRNA添加多聚腺苷酸尾，再利用反转录酶将加尾后的miRNA反转录成cDNA，随后以cDNA为模板，使用通用引物和特异性引物进行PCR扩增，同时借助染料（如SYBR Green）与双链DNA结合产生荧光信号，实现对miRNA的定量检测。 

适用样本：总RNA样本（需包含miRNA），如细胞总RNA、组织总RNA、血清血浆总RNA等。
产品简介

本试剂盒采用SYBR Green I嵌合染料法原理，结合加尾法技术实现miRNA的荧光定量检测。核心组分是经过优化的Hotmaster Taq DNA聚合酶与Buffer体系，可有效抑制非特异性扩增，对宽广浓度范围的模板进行准确定量，具备灵敏度高、特异性强、稳定性好等特点。预混液中含有通用型ROX，适用于所有qPCR仪，无需额外添加ROX校正仪器。 需注意，本试剂盒需与增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒（加尾法）配套使用。

产品组成

组分 规格（125rxn） 规格（500rxn）

2×Universal miRNA SYBR Green qPCR Mix 1.25ml 1.25ml×4

Reverse primer（10μM） 55μl 55μl×4

RNase-Free H₂O 1ml /

自备试剂

待检测miRNA对应的qPCR上游引物（Forward primer），需自行设计合成，设计原则如下：

遵循引物设计通用原则

以成熟miRNA序列为基础，将U替换为T

上游引物Tm值尽量与试剂盒下游引物（Tm=65℃）保持一致

若Tm值过低，可在5’端添加G/C碱基，或在3’端添加A碱基，或同时修饰两端

若Tm值过高，可在5’或3’端去掉部分碱基

操作步骤

一、实验前准备

将DNA模板、引物、2×Universal miRNA SYBR Green qPCR Mix、RNase-Free H₂O溶解后置冰上备用

使用前将2×miRNA qPCR Mix上下颠倒轻轻混匀，避免起泡，轻微离心后使用

二、qPCR反应体系配制（20μl体系）

组分 体积 终浓度

2×Universal SYBR Green qPCR Mix 10μl 1×

miRNA第一链cDNA 1-2μl /

Forward Primer（10μM） 0.4μl 0.2μM

Reverse Primer（10μM） 0.4μl 0.2μM

RNase-Free H₂O 补足至20μl /

注意事项：

miRNA第一链cDNA用量不应超过总反应体系的10%，高丰度miRNA需适当稀释cDNA模板（10倍或100倍）

操作过程中避免强光照射，防止荧光染料分解

引物浓度可在0.1-1.0μM范围内优化，扩增效率低时提高引物浓度，非特异性反应时降低引物浓度

三、qPCR反应程序设置

可选择二步法或三步法扩增：

二步法（特异性高）

预变性：95℃ 30s

扩增循环（40次）：95℃ 5s，60-65℃ 30s（采集荧光信号）

溶解曲线分析：95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s

三步法（扩增效率高）

预变性：95℃ 30s

扩增循环（40次）：95℃ 5s，55-60℃ 30s，72℃ 30s（采集荧光信号）

溶解曲线分析：95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s

注意事项：

退火温度需根据引物Tm值调整

延伸时间需根据qPCR仪数据采集时间调整

溶解曲线分析需按照仪器推荐程序设置

保存条件

试剂盒整体置于-20℃保存，有效期24个月

避免反复冻融，qPCR Mix短期使用可存放于4℃

Reverse primer每次使用后需立即放回-20℃保存

注意事项

实验操作需在无RNase环境中进行，使用无菌无酶耗材

配制反应体系时需在冰上操作，避免试剂降解

若出现非特异性扩增，可适当提高退火温度或优化引物浓度

实验结果需结合溶解曲线分析判断扩增特异性

定量检测需设置标准曲线，标准品梯度建议覆盖5个数量级

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