基本信息
产品名称 | Dpn I | 货号 | P-PR1234 |
规格 | 250U*2 | 用途 | 仅供科研 |
英文名称：Dpn I
作用机制：一种限制性内切酶，特异性识别并切割甲基化的GATC序列，常用于去除质粒DNA模板在PCR扩增后的残留，因为质粒DNA在大肠杆菌中复制时通常会被甲基化，而PCR产物未被甲基化，所以Dpn I可降解质粒模板，避免其对后续实验的干扰。
适用样本：适用于PCR介导的定点突变实验、质粒构建后的模板去除等，样本为PCR反应后的产物（含质粒模板和PCR产物）。
产品概述
Dpn I是一种限制性内切酶，来源于大肠杆菌Dpn I菌株，特异性识别并切割甲基化的DNA序列。它仅能切割双链DNA中被Dam甲基化酶甲基化的GATC序列，对未甲基化的GATC序列无切割作用。在分子克隆实验中，Dpn I常用于定点突变后的模板质粒去除：当使用甲基化的质粒（如从大肠杆菌中提取的质粒，其GATC序列通常被Dam甲基化）作为模板进行PCR突变后，反应体系中同时存在突变后的非甲基化质粒与未突变的甲基化模板质粒，此时加入Dpn I酶切，可特异性降解甲基化的模板质粒，仅保留突变后的非甲基化质粒用于后续转化，有效提高突变体的筛选效率。此外，Dpn I也可用于DNA甲基化分析、质粒鉴定等实验场景。
产品特点
甲基化特异性切割：仅切割Dam甲基化的GATC序列，对未甲基化DNA无作用，特异性极强。
定点突变后模板去除：PCR突变后，特异性降解甲基化的模板质粒，仅保留突变后的非甲基化质粒，有效提高突变体筛选效率。
反应条件温和：37℃孵育1小时即可完成酶切，无需特殊反应条件。
无星号活性：严格识别甲基化GATC序列，无非特异性切割，不影响目的质粒。
操作步骤
一、试剂预处理
取出洗涤液Ⅰ和洗涤液Ⅱ浓缩液，按试剂瓶标注比例加入无水乙醇，充分混匀后备用
将洗脱液置于65℃水浴锅中预热
二、水样处理与核酸富集
取10mL预处理后的水样（杂质较多的水样需先经0.45μm滤膜过滤）加入50mL洁净烧杯
依次加入0.5mL核酸富集因子、5mL病毒裂解液及50μL消化液，充分搅拌混匀
将烧杯置于65℃水浴中孵育15分钟，期间每隔5分钟搅拌一次
三、核酸纯化与洗脱
向烧杯中加入15mL异丙醇，充分搅拌混匀后，将混合液转移至连接富集吸附柱的50mL注射器针筒内
静置2分钟后，开启真空抽滤装置，将液体缓慢抽滤至富集吸附柱内（注意不要抽干）
向针筒内加入5mL洗涤液Ⅰ，静置2分钟后抽滤；再加入5mL洗涤液Ⅱ，静置2分钟后抽滤，重复洗涤液Ⅱ步骤1次
取下富集吸附柱，放入收集管中，12000rpm常温离心3分钟，去除残留洗涤液
将吸附柱转移至新的收集管，加入50-100μL预热的洗脱液，静置2分钟后12000rpm离心2分钟
收集管中的液体即为纯化后的病毒核酸，可直接用于下游实验或-70℃保存
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注意事项
试剂保存：试剂盒应避光保存于2-8℃，有效期12个月；核酸富集因子避免反复冻融，使用后立即放回冰箱
水样预处理：高浊度或杂质过多的水样，需先经0.45μm滤膜过滤，避免堵塞吸附柱
操作规范：实验全程佩戴手套、口罩、护目镜等防护用品，避免直接接触水样与试剂；若不慎接触皮肤或眼睛，立即用大量清水冲洗
试剂配制：洗涤液需现用现配，按比例加入无水乙醇后充分混匀，未使用的稀释液可在2-8℃保存1个月
核酸保存：提取的核酸若长期保存，需置于-70℃环境，避免反复冻融；短期可在4℃保存24小时
器材要求：所有实验器材需为无RNA酶耗材，实验前可经180℃干烤6小时或用RNA酶清除剂处理
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