基本信息
产品名称 | Klenow Fragment(exo-) | 货号 | P-PR1291 |
规格 | 1000U | 用途 | 仅供科研 |
英文名称：Klenow Fragment (exo-)
作用机制：DNA聚合酶I的Klenow片段，缺失3'→5'外切酶活性；具有5'→3' DNA聚合酶活性，可用于DNA片段的补平、标记、测序等实验；常用于平末端DNA的克隆、DNA测序的引物延伸等。
适用样本：DNA片段的补平、标记、测序、平末端克隆等实验，适用于基因克隆、测序、突变分析等研究。
产品概述
Klenow Fragment(exo-)是大肠杆菌DNA聚合酶I经蛋白酶水解后得到的大片段，经过基因工程改造去除了5'→3'核酸外切酶活性，但保留了5'→3'DNA聚合酶活性与3'→5'核酸外切酶校对活性。它能够以DNA为模板，催化脱氧核糖核苷酸（dNTP）聚合形成新的DNA链，可用于DNA片段的末端填充、平末端化、DNA标记、定点突变等分子生物学实验。由于去除了5'→3'核酸外切酶活性，Klenow Fragment(exo-)不会降解DNA链的5'末端，使其在一些特定的DNA修饰实验中更具优势。例如，在DNA片段末端填充反应中，它可将粘性末端的DNA片段填充为平末端；在DNA标记实验中，它可利用随机引物或特异性引物，以DNA为模板合成带标记的DNA探针。Klenow Fragment(exo-)是分子生物学实验室中常用的工具酶之一，为DNA的修饰与合成提供了重要的技术支持。
产品特点
功能多样：兼具5'→3'DNA聚合酶活性和3'→5'核酸外切酶校对活性，可用于多种DNA修饰反应。
平末端化专家：高效填充粘性末端为平末端，是平末端克隆的理想工具。
DNA标记能手：可进行随机引物标记、缺口平移标记等多种DNA标记实验。
保真性好：3'→5'校对活性降低了DNA合成过程中的错配率，产物准确性高。
反应条件宽松：在常温下即可发挥活性，适合多种实验体系。
操作步骤
一、试剂预处理
取出洗涤液Ⅰ和洗涤液Ⅱ浓缩液，按试剂瓶标注比例加入无水乙醇，充分混匀后备用
将洗脱液置于65℃水浴锅中预热
二、水样处理与核酸富集
取10mL预处理后的水样（杂质较多的水样需先经0.45μm滤膜过滤）加入50mL洁净烧杯
依次加入0.5mL核酸富集因子、5mL病毒裂解液及50μL消化液，充分搅拌混匀
将烧杯置于65℃水浴中孵育15分钟，期间每隔5分钟搅拌一次
三、核酸纯化与洗脱
向烧杯中加入15mL异丙醇，充分搅拌混匀后，将混合液转移至连接富集吸附柱的50mL注射器针筒内
静置2分钟后，开启真空抽滤装置，将液体缓慢抽滤至富集吸附柱内（注意不要抽干）
向针筒内加入5mL洗涤液Ⅰ，静置2分钟后抽滤；再加入5mL洗涤液Ⅱ，静置2分钟后抽滤，重复洗涤液Ⅱ步骤1次
取下富集吸附柱，放入收集管中，12000rpm常温离心3分钟，去除残留洗涤液
将吸附柱转移至新的收集管，加入50-100μL预热的洗脱液，静置2分钟后12000rpm离心2分钟
收集管中的液体即为纯化后的病毒核酸，可直接用于下游实验或-70℃保存
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注意事项
试剂保存：试剂盒应避光保存于2-8℃，有效期12个月；核酸富集因子避免反复冻融，使用后立即放回冰箱
水样预处理：高浊度或杂质过多的水样，需先经0.45μm滤膜过滤，避免堵塞吸附柱
操作规范：实验全程佩戴手套、口罩、护目镜等防护用品，避免直接接触水样与试剂；若不慎接触皮肤或眼睛，立即用大量清水冲洗
试剂配制：洗涤液需现用现配，按比例加入无水乙醇后充分混匀，未使用的稀释液可在2-8℃保存1个月
核酸保存：提取的核酸若长期保存，需置于-70℃环境，避免反复冻融；短期可在4℃保存24小时
器材要求：所有实验器材需为无RNA酶耗材，实验前可经180℃干烤6小时或用RNA酶清除剂处理
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