基本信息
产品名称 | T4 DNA Polymerase (exo-) | 货号 | P-PR1294 |
规格 | 250U | 用途 | 仅供科研 |
英文名称：T4 DNA Polymerase (exo-)
作用机制：T4 DNA聚合酶的N端缺失突变体，缺失3'→5'外切酶活性；具有5'→3' DNA聚合酶活性，可用于DNA片段的补平、标记、测序等实验；与Klenow Fragment相比，T4 DNA聚合酶具有更高的合成效率与保真性。
适用样本：DNA片段的补平、标记、测序、平末端克隆等实验，尤其适用于高保真性的DNA合成反应。
产品概述
T4 DNA Polymerase (exo-)是经过基因工程改造的T4 DNA聚合酶，去除了3'→5'核酸外切酶活性，但保留了5'→3'核酸外切酶活性与5'→3'DNA聚合酶活性。它具有独特的酶学特性，在分子生物学实验中有多种应用。5'→3'核酸外切酶活性使其能够从DNA链的5'末端开始降解DNA，可用于DNA片段的末端修剪、去除突出的5'粘性末端等；5'→3'DNA聚合酶活性使其能够以DNA为模板合成新的DNA链，可用于DNA片段的末端填充、平末端化等。例如，在构建平末端DNA文库或进行平末端克隆时，T4 DNA Polymerase (exo-)可同时发挥5'→3'核酸外切酶活性与5'→3'DNA聚合酶活性，将粘性末端的DNA片段转化为平末端。此外，它还可用于DNA序列分析、基因定点突变等实验。T4 DNA Polymerase (exo-)的多功能性使其成为分子克隆与DNA修饰实验中常用的工具酶。
产品特点
双向酶活性：同时具有5'→3'DNA聚合酶活性和5'→3'核酸外切酶活性，功能独特。
平末端化精准：通过聚合酶活性填充粘性末端，同时通过外切酶活性修剪突出末端，实现精准平末端化。
链置换能力强：可置换下游DNA链，用于DNA重组、片段替换等特殊实验。
DNA修复工具：可用于DNA损伤修复、缺口填充等实验研究。
反应可控：通过调整dNTP浓度和反应时间，可精确控制DNA合成和降解过程。
操作步骤
样本处理：向1.5ml EP管中加入600μl miRNA提取试剂，再加入500μl血清或血浆样本，漩涡振荡30秒充分混匀
初步分离：13000rpm离心5分钟，将上清约1ml转移至新的2ml EP管中，加入1ml异丙醇，上下颠倒混合均匀
柱式吸附：将混合液分三次加入吸附柱（每次约700μl），13000rpm离心15秒，倒掉过柱液
洗涤纯化：
向吸附柱中加入700μl 75%异丙醇，13000rpm离心15秒，倒掉过滤液
向吸附柱中加入500μl无水乙醇，13000rpm离心15秒，倒掉过滤液
干燥柱体：吸附柱13000rpm空离心2分钟，去除残留乙醇，室温放置2分钟使乙醇完全挥发
RNA洗脱：在吸附柱滤芯中央加入30μl RNase-Free TE缓冲液，室温静置2分钟，13000rpm离心2分钟，收集滤液即为提取的miRNA产物
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注意事项
样本处理：
血浆抗凝剂建议使用EDTA或柠檬酸钠，避免使用肝素（会抑制PCR检测）
样本应避免反复冻融，新鲜样本建议尽快处理
试剂使用：
miRNA提取试剂含有胍盐，具有强烈腐蚀性，操作时需佩戴防护眼镜、手套和口罩
自备试剂需确保无RNase污染，避免影响RNA完整性
实验操作：
所有操作需在无RNase环境中进行，使用RNase-Free的枪头和离心管
离心过程需确保离心管盖紧，避免液体渗漏
产物检测：
由于血清/血浆中miRNA含量极低，提取产物浓度通常在5ng/μl以下，难以用常规NanoDrop测量，建议直接取10μl进行下游反转录实验
为获得更可靠数据，推荐使用特异性和灵敏度更好的TaqMan探针法进行miRNA定量检测
产物保存：提取的miRNA产物可立即用于下游实验，或分装后置于-80℃长期保存，避免反复冻融
关键字： T4 DNA Polymerase (e;
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