人穿孔素/成孔蛋白(PF/PFP)ELISA试剂盒

本试剂盒采用双抗体夹心ELISA检测原理，微孔板预先包被人PF/PFP特异性捕获抗体，加入待测样本后，样本中的穿孔素/成孔蛋白与固相抗体特异性结合，孵育反应后洗涤除去未结合杂质，加入酶标检测抗体形成夹心免疫复合物，再次洗涤净化体系后加入显色底物，酶催化底物产生显色反应，显色强度与样本中PF/PFP含量呈正相关，通过吸光度检测及标准曲线计算完成定量分析。
产品参数：

‌灵敏度：0.03ng/mL

检测范围：0.1ng/mL–6.4ng/mL

反应时间：95min，样本 50min，酶标二抗 30min，显色 15min

显色系统：增强型单组分显色液

检测波长：450nm

特异性：仅识别人穿孔素，颗粒酶无明显交叉反应

重复性：批内 CV＜5.7%，批间 CV＜7.4%

注意事项：CTL 细胞上清避免反复冻融；终止液具有腐蚀性，规范废液处理。
实验前准备工作：

1. 试剂平衡与稀释

试剂盒所有组分（酶标板、标准品、酶结合物、底物、洗涤浓缩液、样本稀释液、终止液）从 2~8℃取出，室温（20~25℃）放置平衡 30min，严禁直接低温操作。

浓缩洗涤液配制：按标签标注比例用去离子纯水稀释（常见 20× 浓缩液：1 份浓缩液 + 19 份纯水），混匀备用，现配现用。

标准品复溶 / 梯度稀释：

冻干标准品加入配套标准品稀释液充分溶解，室温静置 10min，轻柔吹打混匀；

按说明书梯度倍比稀释出 5~7 个浓度梯度标准品，单独标记，剩余原液分装 - 20℃避光保存，避免反复冻融。

待测样本预处理：血清 / 血浆、组织匀浆、细胞上清用样本稀释液适当稀释，浑浊样本 12000r/min 离心 10min 取上清；溶血、脂血严重样本弃用。

2. 耗材与设备准备

设备：恒温 37℃孵育箱、酶标仪（450nm 主波长，630nm 参比）、多通道移液枪、吸水滤纸、洗板机（或手动洗板槽）、封板膜、离心管。

耗材无核酸酶、无热源、无蛋白污染，移液枪提前校准。

取出本次实验所需酶标板条，剩余未使用板条装入铝箔密封袋，加干燥剂 2~8℃避光保存。

3. 孔位规划标记

酶标板做好分区标记：空白孔、零标准孔、梯度标准品孔、待测样本孔、复孔（所有样本、标准品建议设置双复孔降低误差）。

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实验操作流程：

试剂盒组分室温平衡 34min，配制 PF/PFP 梯度标准品，标记酶标板各组孔位。

加样：标准孔加标准品，样本孔加淋巴细胞上清待测液，空白孔加稀释液。

一步加入酶标记抗体工作液封板，37℃避光孵育 64min。

倒掉孔内反应液，洗板 5 次，浸泡 40s 每次，倒扣拍干微孔。

TMB 显色液避光显色 15min。

终止液终止酶促反应，轻晃混匀。

酶标仪 450nm 读数，换算穿孔素蛋白浓度，记录检测结果。