商品属性:
产品名称 | 脱氢酶(DHA)测试盒 | 货号 | YSH3469 |
规格 | 100管/96样、50管/48样 | 检测方法 | 微量法、可见分光光度法 |
商品介绍:
脱氢酶(dehydrogenase, DHA) 是一类催化物质氧化还原反应的酶,催化底物通过细胞色素系统被氧化,释放的能量供机体使用,是生物体取得能量的一种方式。
测定原理
在细胞呼吸过程中,氢受体2, 3, 5 - 氯化三苯基四氮唑(2,3,5-Triphenyl Tetrazolium Chloride, TTC)在脱氢酶作用下接受氢以后,被还原为三苯基甲鐟(Triphenyl Formazone, TF),TF呈现红色,于485nm测定其吸光值,即得脱氢酶活性。
自备实验仪器及用品
天平、恒温培养箱或水浴锅、低温离心机、酶标仪、96孔板、冰、蒸馏水、甲醇(不允许快递,请用户自备)。
检测原理:
脱氢酶催化底物脱氢氧化:样本脱氢酶催化底物脱去氢原子,氢被人工氧化还原指示剂接收。
指示剂还原显色:无色氧化态 TTC(氯化三苯基四氮唑)接收氢,被还原生成红色甲臜产物。
有机溶剂萃取有色产物:反应结束终止酶活,萃取甲臜至有机相中除去水相杂质。
比色测酶活力:485 nm 测定红色产物吸光度,标准曲线换算脱氢酶活性。
样本前处理方法:
细菌或培养细胞样本收集:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清破碎:按照细菌或细胞数量(10⁴个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次)离心:8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测
组织样本取样:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.05g组织,加入0.5mL提取液),进行冰浴匀浆离心:8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测
血清/血浆样本
血清(浆)样品:直接检测
土壤样本取样:将样本风干、粉碎、过40目筛,然后称取约0.5g、加入2mL提取液(甲苯)提取:震荡提取20min,12000rpm,4℃,离心20min,取上清待测
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测定操作步骤:
比色法/分光光度法/微量法操作仪器预热:可见分光光度计/酶标仪预热30min以上,调节波长到500nm/550nm,蒸馏水调零试剂配制:
试剂二:临用前加入1.5mL蒸馏水充分溶解备用
试剂三:临用前加入1.5mL蒸馏水充分溶解备用样本测定:
试剂名称(μL) 空白管 测定管
蒸馏水/样本 100 100
试剂一 700 700
试剂二 100 100
试剂三 100 100
混匀后37℃水浴10min,记录500nm/550nm处的吸光值A空白和A测定标准曲线绘制:将PLD标准品稀释成0、1、2、3、4、5U/L系列浓度,同样处理,测定500nm/550nm处的吸光值,绘制标准曲线
ELISA法操作试剂准备:将试剂盒从冷藏环境中取出,室温平衡15-30分钟;将20×洗涤缓冲液用蒸馏水20倍稀释后备用加样:
从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条,剩余板条用自封袋密封放回4℃
设置标准品孔和样本孔,标准品孔各加不同浓度的标准品50μL;样本孔中加入待测样本50μL;空白孔不加温育:除空白孔外,标准品孔和样本孔中每孔加入HRP标记的检测抗体100μL,用封板膜封住反应孔,37℃水浴锅或恒温箱温育60min洗涤:弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液(350μL),静置1min,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)显色:每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min终止:每孔加入终止液50μL,15min内,在450nm波长处测定各孔的OD值结果计算:绘制标准曲线,按曲线方程计算样本浓度
关键字: 脱氢酶;DHA;测试盒;
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