背景[1-3]
VEGFA抗体是可以特异性结合VEGFA蛋白的一类单克隆抗体，主要用于体外检测VEGFA蛋白的Western Blot、免疫组化、免疫细胞化学、染色质免疫沉淀(ChIP)、流式细胞术、免疫沉淀和ELISA实验。
VEGFA蛋白是PDGF/VEGF生长因子家族的成员。它编码肝素结合蛋白，以二硫键连接的同型二聚体形式存在。这种生长因子诱导血管内皮细胞的增殖和迁移，对生理性和病理性血管生成都是必不可少的。在小鼠中破坏该基因会导致异常的胚胎血管形成。该基因在许多已知肿瘤中被上调，其表达与肿瘤分期和进展相关。在患有POEMS综合征（也称为Crow-Fukase综合征）的患者中发现这种蛋白质水平升高。该基因的等位基因变异与糖尿病1(MVCD1)和动脉粥样硬化的微血管并发症有关。已经描述了编码不同亚型的选择性剪接转录物变体。还有证据表明，从上游非AUG(CUG)密码子开始的替代翻译会产生额外的亚型。最近的一项研究表明，通过终止密码子通读机制使用替代的框内翻译终止密码子可产生C末端扩展的同种型，并且这种同种型具有抗血管生成作用。来自AUG起始密码子的一些同种型的表达受一个小的上游开放阅读框的调节，该阅读框位于内部核糖体进入位点内。在感染严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)期间，VEGF的水平会增加，从而通过促进炎症细胞的募集和增加血管生成素II(Ang II)的水平来促进炎症，血管生成素II(Ang II)是两种产物之一SARS-CoV-2结合靶标血管紧张素转换酶2(ACE2)。反过来，Ang II促进VEGF升高，从而形成炎症细胞因子释放的恶性循环。
VEGFA抗体
VEGFA抗体在Western Blot实验步骤：
1.组织裂解液的制备
1.1用干净器械解剖目标组织，最好在冰上，并且越快越好以防蛋白酶降解。
1.2将组织放入圆底离心管或Eppendorf管中，浸入液氮中“速冻”。样本在-80°C储存备用，或放在冰上立即匀浆。对于一块约5 mg的组织，向管中迅速加入约300μL裂解液，并用电动匀浆器匀浆，2X裂解液冲洗刀片两次，每次200μL，然后在4℃下（例如将回旋振荡器放入冰箱）持续振摇2小时。裂解液的体积必须根据组织总量决定；蛋白提取物不宜过稀释，以免造成蛋白损失，并尽量减少样本体积，以便凝胶上样。最小浓度为0.1 mg/mL，最佳浓度为1-5 mg/mL。
1.3在微型离心机中4℃下按照12,000 rpm的转速离心20分钟。轻轻地从离心机中取出离心管放置在冰上。将上清液吸出转移到放置在冰上预冷的新管中，弃去沉淀。
2.样本制备
取少量裂解液，用于蛋白质定量分析。测定每种细胞裂解液的蛋白质浓度。
确定蛋白质的上样量，并添加等体积的2X稀释Laemmli样本缓冲液。我们建议使用以下方法对样本进行还原和变性，除非在线抗体数据表显示应使用非还原和非变性条件。
对样本进行还原和变性时，将样本缓冲液中的细胞裂解液在100°C下煮沸5分钟。裂解液可等量分装并在-20°C下储存备用。
3.上样和跑胶
3.1将等量的蛋白和分子量标志物上样至SDS-PAGE凝胶孔中。细胞裂解液或组织匀浆的总蛋白上样量为20-30μg，纯化蛋白的上样量为10-100 ng。
3.2在100 V下跑胶1-2小时。
4.蛋白从凝胶转移到膜
膜可以是硝酸纤维素，也可以是PVDF。用甲醇活化PVDF 1分钟，并在制备转膜层之前用转膜缓冲液冲洗PVDF。转膜时间和电压可能需要优化。我们推荐按照制造商的说明进行操作。可在封闭步骤之前用丽春红染色法检查蛋白质转膜。
5.VEGFA抗体染色
5.1用封闭缓冲液在室温下封闭膜1小时或在4°C下封闭过夜。
5.2用适当稀释的VEGFA一抗在封闭缓冲液中孵育膜。我们建议在4°C下过夜孵育；其他条件可以优化。
5.3用TBST洗涤膜3次，每次5分钟。
5.4用推荐稀释度的偶联二抗在封闭缓冲液中室温孵育膜1小时。
5.5用TBST洗涤膜3次，每次5分钟。
5.6利用暗室显影技术采集化学发光图像，或利用常规图像扫描法采集比色检测图像。
应用[4][5]
VEGFA抗体可以用于miRNA-424-5p经VEGFA通路调控RFM奶牛母体胎盘胶原蛋白降解的机制
以miRNA-424-5p为研究对象,探究miRNA-424-5p在RFM发病过程中的作用并阐明miRNA-424-5p靶向VEGFA调控母体胎盘组织胶原蛋白降解的分子机制,为加深对miRNA-424-5p生物学功能的认知,深入揭示奶牛胎衣不下发生病因学提供科学依据.
主要研究内容如下:首先采用qRT-PCR和VEGFA抗体Western blot技术检测健康及RFM奶牛母体胎盘组织中miRNA-424-5p、VEGFA信号通路关键分子、基质金属蛋白酶MMPs及胶原蛋白collagen的表达水平,ELISA法检测组织中ARA浓度变化。运用生物信息学对miRNA-424-5p进行靶基因预测及功能分析,再通过双荧光素酶实验,验证miRNA-424-5p与VEGFA的靶向关系。最后在奶牛子宫内膜上皮细胞中分别过表达和沉默miRNA-424-5p,通过免疫荧光技术观察VEGFA的表达变化;利用qRT-PCR与VEGFA抗体Western blot的实验方法检测miRNA-424-5p、VEGFA信号通路关键分子、基质金属蛋白酶及胶原蛋白的表达水平;ELISA检测ARA的浓度变化。
VEGFA抗体结果显示,与对照组奶牛相比,miRNA-424-5p在RFM奶牛母体胎盘组织中的表达量极显著升高(P<0.01),VEGFA信号通路关键分子(VEGFA、VEGFR2、MEK、ERK1/2、PLA)表达量极显著降低(P<0.01);基质金属蛋白酶(MMP-2、MMP-9)的表达量极显著降低(P<0.01),胶原蛋白(COL-III、COL-IV)的表达量极显著升高(P<0.01),ARA浓度极显著降低(P<0.01);生物信息学分析结果显示,预测的靶基因功能富集于参与新生血管生成的细胞迁移等9个生物学过程(P<0.01),主要参与MAPK信号转导通路、PI3K-Akt信号通路等19个通路(P<0.05);双荧光素酶结果显示,与对照组相比,miRNA-424-5p+VEGFA组双荧光素酶活性显著低于对照组(P<0.01),VEGFA是miRNA-424-5p的靶基因。
VEGFA抗体体外实验结果显示在UCE细胞中过表达miRNA-424-5p时,VEGFA通路关键基因(VEGFA、VEGFR2、MEK、ERK1/2、PLA)表达水平均极显著降低(P<0.01),免疫荧光结果显示VEGFA的荧光强度显著降低(P<0.01),ARA浓度显著降低(P<0.01),基质金属关蛋白酶MMP-2、MMP-9表达水平显著降低(P<0.01),而胶原蛋白COL-III、COL-IV表达水平显著升高(P<0.01),而沉默miRNA-424-5p的表达时,上述因子的表达变化则呈反向趋势,且差异极显著(P<0.01)。
参考文献
[1]The SLC19A1-AS/miR-1343/WNT11 axis is a novel positive regulatory ceRNA network governing goat granulosa cell proliferation.[J].Runan Zhang;Zuyang Zhou;Peng Wang;Xiaoyun He;Yufang Liu;Mingxing Chu.International journal of biological macromolecules.2024
[2]Deciphering Estrus Expression in Gilts:The Role of Alternative Polyadenylation and LincRNAs in Reproductive Transcriptomics[J].Mingzheng Liu;Jiahao Chen;Chunlei Zhang;Shuhan Liu;Xiaohuan Chao;Huan Yang;Asim Muhammad;Bo Zhou;Weiping Ao;Allan P.Schinckel.Animals.2024
[3]Colocalization of protein and microRNA markers reveals unique extracellular vesicle subpopulations for early cancer detection.[J].Zongbo Li;Kaizhu Guo;Ziting Gao;Junyi Chen;Zuyang Ye;Minghui Cao;Shizhen Emily Wang;Yadong Yin;Wenwan Zhong.Science advances.2024
[4]Over-expression of mir-181a-3p in serum of breast cancer patients as diagnostic biomarker[J].Fouladi Hadi;Ebrahimi Amir;Derakhshan Sima Mansoori;Khaniani Mahmoud Shekari.Molecular Biology Reports.2024
[5]刘炳琦.miRNA-424-5p经VEGFA通路调控RFM奶牛母体胎盘胶原蛋白降解的机制[D].黑龙江八一农垦大学,2024.