背景技术
甜味剂是一类广泛应用于食品、饮料及糖果生产的食品添加剂,其既可以在食品的生产过程中添加,也可以在家庭烘焙时经过适当稀释作为蔗糖的替代品使用。甜味剂包括天然甜味剂和人工甜味剂,前者如蔗糖、高果糖玉米糖浆、蜜糖等,后者如阿斯巴甜、糖精等。甜菊糖是一类从植物甜菊中提取出来的天然甜味剂,目前已被广泛用在食品及饮料中。甜菊的提取物中含有包含瑞鲍迪甙在内的多种甜菊糖,天然提取的甜菊糖不同的批次成分差异较大,需要后续的提纯。目前商业化的产品瑞鲍迪甙A包含一些其它的甜菊糖如瑞鲍迪甙C,D及F等。提取的方法制备的甜菊糖通常还有混有一些杂质,有可能对其使用范围造成一定的影响。瑞鲍迪甙M相较于瑞鲍迪甙A具有优势,但其在甜菊叶中的含量极少,且只在甜菊Morite植株中被检测到 (2010,J. Appl.Glycosci.,57, 199-209)。目前尚未有瑞鲍迪甙M的商业化生产。
中国专利文献CN1033970641公开了一种酶法制备瑞鲍迪甙M的方法,该方法利用大肠杆菌制备的UDP-葡萄糖基转移酶或含有UDP-葡萄糖基转移酶的大肠杆菌,在葡萄糖基供体存在的情况下,催化瑞鲍迪甙A或瑞鲍迪甙D生成瑞鲍迪甙M。上述方法中,所利用的生产UDP-葡萄糖基转移酶的基因工程菌-大肠杆菌并不是安全的菌株(GRAS,generalregarded as safe),其在培养过程中会产生毒素，生产的瑞鲍迪甙M不能直接应用,并且大肠杆菌为原核生物，UDP-葡萄糖基转移酶的基因来自于真核生物,因为真核生物和原核生物的蛋白表达过程的复杂程度不同,用原核细菌表达真核来源的酶,会影响酶的活性。酿酒酵母是公认安全的菌株,但是在酵母菌中表达外源基因的表达量较低。
制备方法[1]
利用含有UDP-葡萄糖基转移酶的重组酿酒酵母或其制备的UDP-葡萄糖基转移酶,在葡萄糖基供体存在的情况下,催化瑞鲍迪甙A或瑞鲍迪甙D生成瑞鲍迪甙M,所述重组酿酒酵母通过以下方法构建：在质粒中引入强启动子得到载体质粒,将UDP-葡萄糖基转移酶基因通过酶切位点插入到所述载体质粒上置于所述强启动子控制之下得到表达载体，然后转化酿酒酵母,得到重组酿酒酵母。
以瑞鲍迪甙D为底物酶法合成瑞鲍迪甙M：在反应体系中依次加入100mL 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0),0.224g UDP，34.2g蔗糖,0.2g瑞鲍迪甙D，UGT-A冻干粉1g以及SUS冻干粉0.4g，混合均匀后置于37℃水浴，200rpm搅拌反应18h。反应结束后,取300u1反应液加入600ul 3%甲酸水混匀，10000rpm离心5min取上清液过滤膜后用高效液相色谱检测(色谱条件:色谱柱:Agilent eclipse sb-C18 4.6X150mm；检测波长:210nm；流动相:甲醇:水=68%:32%；流速:1.0mL/min；柱温:30℃)。瑞鲍迪甙D的转化率为90%以上。经树脂分离、结晶等后处理纯化后得到瑞鲍迪甙M 0.1g,纯度大于99%。
参考文献
[1]苏州汉酶生物技术有限公司,百事可乐公司. 一种利用酿酒酵母酶法制备瑞鲍迪甙M的方法:CN201510375211.8[P]. 2015-12-30.