介绍
N-甲基-N-亚硝基苯胺（N-Nitroso-N-methylaniline，NMA）是一种典型的芳香族N-亚硝胺类化学致癌物，具有显著的器官特异性致癌效应，可特异性诱导大鼠食管肿瘤与小鼠肺肿瘤的发生，慢性染毒下大鼠肿瘤发生率接近100%。活化的NMA可与脱氧鸟苷3'-单磷酸（dGp）、脱氧腺苷3'-单磷酸（dAp）形成共价加合物，且对dGp的修饰效率是dAp的23倍以上。
图一 N-甲基-N-亚硝基苯胺
致癌性
N-甲基-N-亚硝基苯胺的致癌性于20世纪70年代被首次证实。Druckrey等学者通过慢性染毒实验发现，1.8或2.1mmol/kg剂量的NMA可诱导BD大鼠食管肿瘤发生率接近100%，同时可引发小鼠肺组织肿瘤，展现出极强的器官靶向致癌能力。后续研究进一步证实，NMA的致癌效应依赖于肝脏微粒体CYP酶系的代谢活化，其α-C羟基化代谢产物可自发分解生成苯重氮离子（BDI），而该离子被认为是NMA发挥致癌效应的核心活性中间体。
代谢活化与失活
N-甲基-N-亚硝基苯胺的致癌效应完全依赖于体内的生物转化过程，其代谢途径主要由CYP酶系介导，分为活化致癌与解毒失活两条平行路径，其中CYP2B1是调控两条代谢途径的核心同工酶。实验采用苯巴比妥（PB）预处理的大鼠肝微粒体（富含CYP2B1，CYP含量达2.97nmol/mg蛋白）进行代谢研究，证实该酶系可高效催化NMA的氧化反应，超过30%的底物可在10min内被氧化代谢。
代谢活化
α-C羟基化是NMA发挥致癌效应的必经途径，该过程由CYP2B1特异性催化。N-甲基-N-亚硝基苯胺分子中与N-亚硝基相连的甲基发生羟基化，生成不稳定的α-羟基-N-亚硝基-N-甲基苯胺中间体。该中间体在生理条件下无需酶催化即可自发分解，释放出甲醛，同时生成高活性的苯重氮离子（BDI），这也是NMA的终极致癌活性代谢产物。代谢体系中可检测到苯酚的生成，而苯酚是BDI水解的特征产物，加入BDI特异性捕获剂1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮后，苯酚的生成量可下降50%，代谢过程中产生了BDI。CYP2B1的特异性抑制剂可剂量依赖性抑制NMA的N-去甲基化反应（α-C羟基化的特征反应），其中美替拉酮、金刚烷、金刚烷烃均可显著抑制甲醛的生成，且抑制效率与CYP2B1的结合亲和力呈正相关，证实CYP2B1是NMAα-C羟基化的核心催化酶。
图二 经苯巴比妥预处理的大鼠微粒体对NMA的氧化代谢
代谢失活
除活化途径外，N-甲基-N-亚硝基苯胺还可通过CYP2B1介导的脱亚硝基反应进行代谢解毒。该过程中，NMA的N-N键发生断裂，生成苯胺、N-甲基苯胺、对甲基氨基酚与亚硝酸盐，无法生成致癌性的BDI，因此被公认为NMA的代谢失活途径。PB诱导的大鼠肝微粒体代谢NMA后，体系中可稳定检出苯胺、对氨基酚等脱亚硝基产物，其生成量可被CYP2B1抑制剂显著抑制，进一步证实该过程同样由CYP2B1同工酶介导。两条代谢途径的竞争关系，决定了NMA在体内的致癌效应强度：当α-C羟基化途径占优时，BDI生成量增加，致癌风险显著升高；当脱亚硝基途径占优时，NMA被快速解毒，致癌效应随之降低。
致癌的分子机制
采用PB诱导的大鼠肝微粒体活化N-甲基-N-亚硝基苯胺，分别与脱氧腺苷3'-单磷酸（dAp）、脱氧鸟苷3'-单磷酸（dGp）进行孵育，通过核酸酶P1增强版³²P后标记技术进行分析发现。活化的NMA与dAp、dGp孵育后，均在聚乙烯亚胺（PEI）-纤维素薄层色谱上检出单一的加合物放射性斑点；而对照组（无微粒体活化体系、无脱氧核苷酸底物）均未检出任何加合物信号，说明只有经CYP2B1代谢活化的NMA，才能与脱氧核糖核苷酸形成共价加合物。
加合物形成具有显著的碱基偏好性。通过相对加合物标记值（RelativeAdductLabeling,RAL）进行定量分析发现，活化N-甲基-N-亚硝基苯胺对dGp的修饰效率（RAL=1.54±0.23/10⁷），是对dAp修饰效率（RAL=0.065±0.010/10⁷）的23倍以上。这一结果表明，鸟嘌呤是NMA致癌的主要靶碱基，鸟嘌呤加合物是其引发基因突变的核心DNA损伤类型。
BDI与腺嘌呤反应生成的N⁶-腺嘌呤三氮烯加合物，本身具有酸不稳定性，在核酸提取、酶解的弱酸性环境中易发生分解。而BDI与鸟嘌呤反应可生成稳定的8-苯偶氮鸟嘌呤加合物，该产物在酸性与中性环境中均能稳定存在。基于此，研究推测N-甲基-N-亚硝基苯胺代谢生成的BDI，主要与鸟嘌呤的C8位发生偶联反应，生成8-苯偶氮鸟嘌呤加合物，这也是其最主要的致癌相关DNA损伤。
DNA加合物的致癌生物学
N-甲基-N-亚硝基苯胺代谢生成的BDI与DNA碱基形成的共价加合物，可通过多种途径引发细胞恶性转化，最终诱导肿瘤发生。稳定的鸟嘌呤加合物可在DNA复制过程中阻碍DNA聚合酶的正常碱基配对，引发G→T、G→C颠换突变，这类突变是原癌基因（如Ras家族）激活、抑癌基因（如p53）失活的常见突变类型，是肿瘤发生的关键驱动事件；不稳定的腺嘌呤加合物分解后，会形成脱嘌呤位点与DNA单链断裂，若损伤无法被精准修复，会引发基因组不稳定性，进一步加速细胞的恶性转化进程；其三，BDI还可与细胞内的RNA、蛋白质发生共价结合，干扰蛋白质的正常功能与基因的转录翻译过程，协同促进细胞的恶性表型形成[1]。
参考文献
[1] STIBOROVá M, SCHMEISER H H, WIESSLER M, et al. Direct evidence for the formation of deoxyribonucleotide adducts from carcinogenic N-nitroso-N-methylaniline revealed by the 32P-postlabeling technique [J]. Cancer Letters, 1999, 138 (1-2): 61-66. DOI:10.1016/S0304-3835 (98) 00369-3.