羊毛甾醇的含量测定

前言

羊毛甾醇又名异胆固醇,化学名为(3β)-8,24羊毛甾二烯3-醇,为白色无臭粉末,属于四环三萜类化合物,是胆甾醇生物合成的中间体。羊毛甾醇是存在于羊毛脂内一种重要的甾醇类,具有重要的生理作用,如抗癌、降血压、消炎、缓解实验动物的白内障病情等。有文献提出了羊毛甾醇具有缓解和预防白内障进展的作用以及对结肠癌具有一定的化学预防作用,也是化妆品,医药,化工行业中的一种重要原料。

羊毛甾醇的分子式是C₃₀H₅₀O;分子量426;熔点140℃~141℃;溶于氯仿、乙醇、乙醚。羊毛甾醇合成的第一个关键步骤为2,3-环氧角鲨烯环化形成羊毛甾醇(LA)或环木菠萝烯醇(CA),通过氧化角鲨烯环化酶(OSC)催化,LA和CA可通过一系列酶反应转化成各种甾醇。

本文使用高效液相色谱(HPLC)法对羊毛甾醇进行含量测定,该方法更为简便且准确度高,效果较为理想,为羊毛甾醇的含量分析及相关研究提供了更简便、可靠的方法。

检测方法^[1]

1、色谱条件

色谱柱:InfinityLab Poroshell 120 Ee-C₁₈(4.6x150mm,5um);柱温:35℃;流动相:100%甲醇;流速:1.0mL・min^-1;检测波长:210nm;进样量:10uL;洗脱方式:等度洗脱。

2、溶液的制备

2.1对照品溶液制备：取羊毛甾醇对照品适量,精密称定,加甲醇溶解并稀释成每1mL中约含0.1mg羊毛甾醇的溶液,摇匀,作为对照品溶液。

2.2供试品溶液制备：称取羊毛甾醇原料约10.00mg,精密称定,置100mL棕色量瓶中,加入适量甲醇,超声使溶解,用甲醇稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶液。

3、系统适应性试验

分别取甲醇、羊毛甾醇对照品溶液10uL,按“1”项下色谱条件注入色谱仪进行测定,羊毛甾醇与甲醇的峰分离度良好。

另取氧化破坏实验样品溶液10uL,按“1”项下色谱条件注入色谱仪进行测定,羊毛甾醇峰与相邻杂质峰分离度均大于1.5,主峰纯度在998以上,理论塔板数大于10000(理论塔板数=3000)。

4、专属性试验

取羊毛甾醇原料共6份,每份10mg,精密称定，分别置10mL烧杯中,按以下方法进行处理。①酸破坏:加入0.1mol・L^-1HCl溶液1mL,置60℃水浴中破坏60min;②碱破坏:加入0.1mol・L^-1 NaOH 溶液1mL,置60℃水浴中破坏60min;③光照破坏:置可见光光照5000Lux下破坏3d;④高湿破坏:于室温、湿度大于85%的环境下破坏3d;⑤氧化破坏:加入3%H2O2溶液1mL,置60℃水浴中破坏60min;⑥高温破坏:置鼓风干燥箱中105℃加热30min。取上述溶液,分别转移到50mL棕色量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀即得。取稀释后的溶液各10uL,按“1”项下色谱条件注入色谱仪进行测定,实验结果表明,羊毛甾醇峰与其相邻杂质峰均能达到完全分离,分离度均大于1.5,理论塔板数均符合规定,方法的专属性良好。

羊毛甾醇氧化破坏试验图谱

5、重复性试验

取羊毛甾醇原料10mg,精密称定,置100mL棕色量瓶中,加入适量甲醇,超声使溶解,用甲醇稀释至刻度,摇匀即得,平行制备6份。取上述溶液各10μL,按“1”项下色谱条件注入色谱仪进行测定,含量测定的结果RSD为1.2%,表明方法重复性良好。

6、线性范围

取羊毛甾醇对照品适量,精密称定,用甲醇配制成系列浓度溶液,浓度分别为:0.04849mg・mL^-1、0.06462mg・mL^-1、0.08078mg・mL^-1、0.09694mg・mL^-1、0.1131mg・mL^-1,按“1”项下色谱条件注入色谱仪进行测定,记录峰面积;以峰面积(y)为纵坐标,浓度(x)为横坐标,建立回归方程,线性回归方程为y=4 638.7534x+61.8350,相关系数为1.0000;试验结果表明在0.04849mg・mL^-1~0.1131mg・mL^-1的浓度范围内线性关系良好。

羊毛甾醇线性回归

7、仪器精密度试验

取“2.1”项下羊毛甾醇对照品溶液按“1”项下色谱条件连续进样8次进行测定,记录峰面积，RSD为0.2%(n=8),结果表明仪器精密度良好。

8、检测限及定量限

精密量取“2.1”项下的羊毛甾醇对照品溶液适量,用甲醇逐级稀释成系列浓度,按照“1”项下的色谱条件进行测定,记录色谱图。以信噪比S/N =3:1计算检测限,以信噪比S/N =10:1计算定量限。检测限为0.008mg・ml^-1,定量限为0.08mg・mL^-1。

9、溶液稳定性试验

取“2.1”项下羊毛甾醇对照品溶液及“2.2”项下羊毛甾醇供试品溶液,按照“1”项下的色谱条件进行测定,在室温放置0、6、8、12、24、48h后峰面积的变化,计算RSD值,对照品溶液主峰面积的RSD值为1.1%,3个厂家的供试品溶液主峰面积的RSD分别为1.6%.1.0%和1.1%,结果表明对照品溶液和供试品溶液在48h内稳定。

10、耐用性试验

取“2.1”项下羊毛甾醇对照品溶液,按照“1”项下的色谱条件,分别考察了流动相比例,流速,柱温变化,羊毛甾醇峰的理论板数均符合规定(理论塔板数>3000),羊毛甾醇峰与相邻杂质峰的分离度均大于1.5。

另取GL Sciences Intertsil ODS-SP C₁₈(4.6x150mm,5um)色谱柱,取“2.1”项下羊毛甾醇对照品溶液，按照“1”项下的色谱条件进行测定,记录峰面积并与“6”项下羊毛甾醇对照品溶液峰面积比较,RSD为0.3%,且光谱纯度均大于0.999,结果表明方法耐用性良好。

11、样品含量的测定

取“2.1"项下羊毛甾醇对照品溶液及“2.2”项下3个批次的羊毛甾醇样品溶液,按照“1”项下的色谱条件进行测定,记录色谱图,按外标法以峰面积计算各个批次羊毛甾醇含量,检测结果见下表。

羊毛甾醇样品的含量检测结果

参考文献

[1] 钱绍安,梁云,臧广喜,等. HPLC法测定羊毛甾醇含量研究[J]. 中国药物评价,2021,38(6):513-517. DOI:10.3969/j.issn.2095-3593.2021.06.010.