当前，全世界范围内由于肝病、肾病等原因需要移植器官的患者数量逐年增加。中国每年需要器官移植的患者人数约有30万人。中国于2018年共完成器官移植手术20201例，位居世界第二位，亚洲第一位。器官移植作为这些患者的重要治疗手段，越来越受到广泛重视。早在20世纪70年代末，科学家们就发现一些真菌代谢产物具有很强的免疫抑制作用，且选择性较好。在发现他克莫司之前，临床上常用环孢素A（CsA）作为免疫抑制剂来治疗器官移植后的排斥反应。CsA也是一种CaN抑制剂，免疫抑制机制与他克莫司类似，但他克莫司的作用效果是CsA的100倍左右。1993年，他克莫司胶囊在日本首次批准上市，商品名是“普乐可复”。随后其经FDA 获准后，相继在多个国家上市使用。
他克莫司自上市以来广泛用于肝、肾和骨髓移植的急慢性排斥治疗，已成为临床上肝、肾移植后治疗排斥反应的一线药物。国内的他克莫司市场基本上被Astellas公司的原研药“普乐可复”所占据，且原研药“普乐可复”较国内同类产品价格高出30％～50％左右。1mg规格的他克莫司胶囊，原研药品销售价格在1200元左右。
生物合成研究
1984年 ，日本藤泽公司研究所从日本筑波山土壤中分离出的筑波链霉菌发酵液中提取得到了他克莫司。但最初的他克莫司的发酵产量极低。不过通过对发酵条件的优化，产量可提高10倍以上。在此基础上进行了菌株的改良和发酵条件的进一步优化，生产能力提高了几十倍。
国内一些研究是围绕发酵培养基条件优化和原始菌株诱变筛选展开的。邱观荣等通过实验选择玉米淀粉及葡萄糖作为主碳源，选用黄豆粉和玉米浆为主氮源，且确定最佳碳氮源组合（质量分数）为2.0％葡萄糖，6.0％玉米淀粉，2.0％黄豆粉，0.5％玉米浆。最终得到适合的种子菌龄为48h，培养基的初始pH为7.5，500mL三角瓶较佳装液量为50mL，摇瓶适宜转速为250r/min，适宜发酵温度为27℃，最佳接种量为10％（质量分数），最佳发酵周期为7d。优化组发酵液中的平均发酵水平最终达586μg/mL，与对照组相比提高60％以上。顾骏等先通过两水平因子设计方法找到培养基中重要的影响因子，然后确定其合适的浓度范围，再通过中心组合设计及响应面分析方法，最终确定培养基各成分最佳的浓度配比。经优化得到的最佳培养基为葡萄糖6.14g/L，酵母粉1.52g/L，黄豆饼粉5g/L，花生饼粉12.28g/L，玉米淀粉30g/L，K2HPO4 5g/L。相对于初始发酵培养基，他克莫司产量由60μg/mL提升至90 μg/mL ，提高了约55％。
傅立峰等通过研究不同发酵条件对他克莫司发酵的影响，获得了最适摇瓶发酵培养条件：种子培养基中以1.5g/L葡萄糖为辅碳源，种子培养时间40h，500mL摇瓶适宜装液量为20mL ，适宜接种量为10％（质量分数）；20吨发酵罐发酵培养过程中溶氧控制在20％以上，适宜发酵周期为7d，在发酵第4天和第5天进行分批补料，最终发酵得到他克莫司的质量浓度为1150μg/mL。
王会会等采用具有低成本、操作方便等优点的常压室温等离子体（ARTP）技术对他克莫司产生菌进行诱变处理。利用ARTP诱变20s，获得初始突变菌，从初筛的127株菌株中得到4株高产的诱变菌株，其中FK18-1-56较出发菌株产量提高了162％，且连续传4代菌株产量稳定。王秀琴等通过复合诱变方法筛选得到新菌株08-9-81较出发菌株的发酵水平提高73.6％。
Kosec等开发了一种新的化学生物合成方法能够显著减少副产物子囊霉素（FK520）和双氢他克莫司（FK506D）的产生。在 Streptomyces tsuku baensis allR基因缺失突变株的发酵过程中外源添加烯丙基丙二酰-SNAC可观测到仅有FK506的生成，没有可检测量FK520及FK506D的产生。但其他克莫司（FK506）的产量显著低于野生型，经对照组对比分析结果可得烯丙基丙二酰-SNAC对野生型菌株具有一定毒性。此后还可通过菌株筛选和进料优化进一步提高FK506产量。
Xia等通过代谢组学，利用主成分分析（PCA）和偏最小二乘法分析（PLS）两种分析方法分别分析了中心碳代谢途径（EMP、TCA和PPP）、莽草酸途径、氨基酸代谢途径和脂肪酸代谢途径中的23种主要代谢物；通过比较代谢分析确定了13种关键代谢物与他克莫司的合成密切相关；通过分析不同时间不同浓度的补料与产量之间的关系最终确定了一个合理的补料策略。首先他们发现适量乳酸的添加能增加FK506的产量，在36h添加终质量浓度为15g/L的乳酸能使FK506产量从251mg/L增加到281mg/L；同时观察到外源添加丙酮酸会使菌体生长和产物生成均受到抑制；其原因可能是菌株不能有效利用外源营养物质以及有机酸的积累导致发酵液pH的降低。在96h添加终质量浓度为1.5g/L的琥珀酸钠能使他克莫司的产量提高28％达到321mg/L。在72h添加1.5g/L莽草酸、0.1g/L苯丙氨酸、酪氨酸与色氨酸能使产量最大提高达到41.8％。缬氨酸、脯氨酸、亮氨酸和苏氨酸的添加会使得细胞内各种CoA酯增加，从而显著刺激他克莫司的产生。在24h加入10g/L豆油会使FK506产量提高44％，表明脂肪酸和CoA酯前体的形成密切相关。
Wang等也观测到三酰甘油能削弱链霉菌中乙酰CoA到TCA的碳通量同时增强聚酮化合物的生成，他们将相关基因SCO6196置于二甲氨基二硫代甲酸铜（Cumate）诱导启动子控制下，构建了相关ddTAG策略，通过选择性控制TAG降解的时间和强度有效提高相关聚酮化合物产量。他们在放线菌素、杰多霉素B、土霉素以及阿维菌素B1a生产菌株中都成功应用了该策略使得他克莫司产量得到了提升[1]。
参考文献
[1] 金美英,方晨捷,陈燏,等. 免疫抑制剂他克莫司研究进展[J]. 发酵科技通讯,2020,49(1):37-43,57.