一、GSH/GSSG比率的生物学意义
细胞内谷胱甘肽主要以还原型（GSH）和氧化型（GSSG）两种形式存在。GSH是细胞内最丰富的非蛋白巯基化合物，在清楚活性氧自由基，维持氧化还原平衡机解毒代谢重发挥核心保护作用。当细胞暴露于氧化应激时，GSH被氧化为GSSG，导致GSH/GSSG比率下降。在谷胱甘肽还原酶催化下，GSSG可被重新还原为GSH，同时伴随β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）的氧化。因此，生物样品中GSH/GSSG比率及GSSG含量的精准测定，是评估细胞和组织氧化应激状态及解毒能力的关键指标。
目前市售试剂盒普遍存在灵敏度不足或操作流程繁琐的问题，难以满足微量样品检测与高通量筛选的需求。
二、检测原理与核心性能指标
由艾美捷代理AAT Bioquest推出的Amplite® 快速荧光法GSH/GSSG比率检测试剂盒（绿色荧光），货号：AAT-10060，采用专有的水溶性非荧光探针Thiolite™ Green 520WS，该探针与游离巯基反应后产生强烈绿色荧光信号，激发/发射波长为490/525 nm（推荐截止滤光片515 nm）。
核心性能指标：
-检测下限低至1 pmol（以半胱氨酸或GSH计，100 μL体系对应10 nM浓度）
-一步法操作，无需分离步骤
-适配96孔或384孔黑色微孔板，兼容自动化高通量平台
-GSH和GSSG标准品独立配制，分别建立标准曲线
三、操作流程与关键参数
3.1 仪器与材料要求
项目 | 规格
检测仪器 | 荧光微孔板读数仪
激发波长 | 490 nm
发射波长 | 525 nm
截止滤光片 | 515 nm
推荐板型 | 实心黑色微孔板
重要提示：实验开始前将所有组分恢复至室温。所有配置后的储备液应分装单次用量，于-20℃避光保存，避免反复冻融。
3.2 储备液配制
GSH标准溶液（1 mM）：向GSH标准品（组分C）小管中加入200 μL Assay Buffer（组分B），配制成1 mM（1 nmol/μL）GSH标准溶液。
GSSG标准储备液（1 mM）：向GSSG标准品（组分E）小管中加入200 μL ddH₂O，配制成1 mM（1 nmol/μL）GSSG标准溶液。
Thiolite™ Green 520WS储备液（100×）：向Thiolite™ Green 520WS（组分A）小管中加入100 μL ddH₂O，配制成100×储备液。
> 注意：储备液及工作液均需避光保存。
3.3 标准曲线制备
GSH标准曲线（0 ~ 10 μM）：
取10 μL的1 mM GSH标准溶液，加入990 μL Assay Buffer，配制成10 μM（10 pmol/μL）GSH标准溶液（GSH7）。取10 μM GSH标准溶液，用Assay Buffer进行1:2梯度稀释，得到GSH6 ~ GSH1系列标准品。
GSSG标准曲线（0 ~ 5 μM）：
取10 μL的1 mM GSSG标准溶液，加入990 μL Assay Buffer，配制成10 μM（10 pmol/μL）GSSG标准溶液（GSSG7）。取10 μM GSSG标准溶液，用Assay Buffer进行1:2梯度稀释，得到GSSG6 ~ GSSG1系列标准品。
> 注意：稀释后的GSH和GSSG标准溶液均不稳定，建议配制后4小时内使用。
3.4 检测流程
1. 每孔加入50 μL Thiolite™ Green工作溶液；
2. 加入50 μL GSH标准品、GSSG标准品或待测样品；
3. 室温孵育10 ~ 60分钟；
4. 在Ex/Em = 490/525 nm处监测荧光强度增加值。
四、方法学验证与质量控制
灵敏度验证：本方法在100 μL体系中检测下限达10 nM（1 pmol/孔），适用于细胞裂解液、组织匀浆等低浓度样品分析。
线性范围：GSH标准曲线在0.01 ~ 10 μM范围内呈现良好线性关系（R² > 0.99），GSSG标准曲线在0.005 ~ 5 μM范围内线性良好。
特异性：Thiolite™ Green探针特异性响应游离巯基。GSH标准曲线用于定量样品中的总游离巯基含量，GSSG标准曲线则用于氧化型谷胱甘肽的定量。
五、常见问题与操作要点
1. 还原剂干扰：样品中若含DTT、β-巯基乙醇或TCEP，需预先脱盐处理，否则会导致假阳性信号。
2. pH控制：反应体系pH建议维持在7.0 ~ 8.0之间，偏离此范围可能影响探针反应效率。
3. 孵育时间优化：高浓度样品（>10 μM）孵育10分钟即可达到平台期，低浓度样品（<1 μM）建议延长至60分钟。
4. 样品制备：细胞或组织样品需快速处理，避免GSH在制备过程中被氧化。建议在含EDTA的缓冲液中裂解，并尽量在冰上操作。
5. 背景扣除：每个实验板应包含空白对照（不含GSH/GSSG），最终荧光信号为实测值减去空白对照值。
六、总结
Amplite® 快速荧光法GSH/GSSG比率检测试剂盒以“开启型”荧光探针为核心技术，提供了一种高灵敏度、操作简便的GSH/GSSG比率测定方案。1 pmol级的检测下限使其适用于珍贵样品的氧化应激状态评估，为抗氧化药物筛选、毒理学研究和代谢性疾病机制探索提供了高效可靠的工具。