一、基础概述

Cy5.5-MAL 是巯基特异性近红外活性花菁荧光染料，由 Cy5.5 荧光母核 + 马来酰亚胺（Maleimide）活性基团组成，专门用于定点标记含巯基（-SH）生物分子，是活体成像、蛋白偶联主流试剂。

磺化Cy5.5-MAL结构式

商品化试剂实物

1. 基础参数

• 常用 CAS：1594414-90-0（磺化水溶型）、1593644-50-8（脂溶普通型）

• 外观：深蓝 / 深紫色粉末，避光、防潮

• 分子量：760–1040 Da（磺化 / 非磺化版本差异大）

• 荧光光谱（核心）

• 最大激发 λₑₓ：675–685 nm

• 最大发射 λₑₘ：695–710 nm

• 摩尔消光系数：190000–250000 M⁻¹・cm⁻¹

• 量子产率：0.20–0.27；pH4–10 荧光强度几乎无变化

• 溶解性分两类：

1. 普通 Cy5.5-MAL：溶于 DMSO、DMF、甲醇；几乎不溶于水，标记需加有机助溶剂

2. 磺化 sulfo-Cy5.5-MAL：双磺酸修饰，完全水溶，适合不耐有机溶剂的蛋白 / 抗体VectorLabs

二、标记反应原理（马来酰亚胺核心特性）

1. 特异性反应靶点

pH 6.5–7.5 中性缓冲液下，专一结合巯基（半胱氨酸 - SH），与氨基（赖氨酸）反应速度差 1000 倍，定点标记、副反应极少。

反应：迈克尔加成，生成稳定不可逆硫醚键，偶联产物常温 / 体内长期稳定。

2. pH 关键控制（实验重点）

• pH 6.5–7.5：最优，只标记巯基

• pH＞7.8：马来酰亚胺快速水解失活，同时非特异性结合赖氨酸氨基，背景升高

• 禁止高 pH、长时间孵育

3. 样品预处理要点

蛋白 / 多肽需先用 DTT/TCEP 还原二硫键，再透析除去还原剂（还原剂会消耗染料），暴露出游离 - SH 才能标记。

三、核心优势

1. 近红外窗口成像：690–710 nm 落在生物组织第一近红外窗口，血红蛋白、水自发荧光极低，组织穿透深度 2–4 mm，适合小动物活体肿瘤、皮下组织示踪；

2. 光稳定性优于 Cy5，荧光亮度高、信噪比好；

3. 定点标记：仅修饰半胱氨酸，不破坏蛋白抗原结合位点，优于氨基随机标记（NHS 酯）；

4. 可与 Cy3、Cy7、IRDye800 多通道同时成像，光谱无重叠。

四、主要应用场景

1. 活体小动物近红外成像（IVIS）：标记抗体、多肽、纳米药物、外泌体，体内肿瘤靶向示踪、药物分布检测；

2. 蛋白 / 抗体定点荧光标记：WB 近红外荧光二抗、免疫荧光、流式细胞；

3. 多肽、巯基修饰 DNA/RNA、纳米颗粒（金纳米、脂质体）偶联；

4. 细胞内巯基蛋白示踪、生物传感、分子探针构建。

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