日本乙型脑炎病毒（JEV）核酸检测试剂盒（荧光 PCR 法）

[产品名称]

商品名称：日本乙型脑炎病毒（JEV）核酸检测试剂盒（荧光 PCR法）

Name ：Japanese encephalitis virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)

[包装规格]25T/盒、50T/盒

[预期用途]

日本乙型脑炎，又称流行性乙型脑炎，简称乙脑，是由日本脑炎病毒（Japanese encephalitis，JEV）引起的一种人畜共患传染病[1]。JEV主要是通过带病毒的蚊虫叮咬传播，而猪是 JEV的主要增殖宿主和扩散宿主。JEV可引起妊娠母猪发生流产和死胎、公猪发生睾丸炎，新生仔猪发生脑炎、育肥猪持续高热，对养猪业造成巨大的经济损失。日本乙型脑炎广泛存在于世界许多国家，严重威胁着人类的健康[2]。

本试剂盒适用于检测样本中日本乙型脑炎病毒 RNA，适用于日本乙型脑炎病毒感染的辅助诊断。

[检验原理]

本试剂盒用一对日本乙型脑炎病毒特异性引物，结合一条特异性荧光探针，用一步法荧光 RT-PCR 技术对日本乙型脑炎病毒 RNA 进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染病料的病原学诊断。

[试剂组成]

说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用

[储存条件及有效期]

-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融不超过 5 次，有效期 12 个月。

[适用仪器]

ABI7500、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。

[标本采集]

病死或扑杀动物(包括流产死胎)死亡后 3h 内采取脑组织(选大脑皮质、脑干、中脑、海马回及桥脑)；待检活动物，无菌采集动物的脑脊髓液或采集病畜血液不少于 5 mL于无菌离心管中。

[保存和运输]

采集或处理好的样品在 2℃~8℃条件下保存应不超过 24 h；若需长期保存，应放置-70℃以下保存，冻融不超过 3 次。

[使用方法]

1. 样品处理（样本处理区）

1.1 样本前处理

将采集的动物脑组织或睾丸组织在组织研磨器中充分研磨,加入青霉素500 IU/mL和链霉素500 μg/mL,加入0.5%水解乳蛋白 Hank’s 液,制成 10%悬液,4℃浸泡 3h~4 h,3 000 r/min 离心 30 min,取上清液备用；全血样品待血凝后取血清于 1.5mL 灭菌离心管中备用。

1.2 核酸提取

推荐采用核酸提取或纯化试剂（磁珠法或离心柱法）进行核酸提取，请按照试剂说明书进行操作。

2. 试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为N（N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；反应管数每满 10 份，多配制 1 份），每测试反应体系配制如下表：

将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，20μL/管。

3. 加样（样本处理区）

将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 5μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。

4. PCR扩增（核酸扩增区）

4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR仪反应槽内；

4.2 设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；荧光通道选择： 检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光，选择 None 即可。

4.3 推荐循环参数设置：

5. 结果分析判定

5.1 结果分析条件设定（请参照各仪器使用说明书进行设置，以分析 ABI7500 仪器为例）

反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节 Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用户可根据实际情况自行调整，Start 值可设在 3～15、End 值可设在 5～20，使阈值线位于扩增曲线指数期，阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线），点击 Analyze 自动获得分析结果。

5.2 结果判断

阳性：检测通道 Ct 值≤40，且曲线有明显的指数增长曲线；

阴性：样本检测结果无 Ct 值，且无特异性扩增曲线；

可疑：样本检测结果 40值≤45，建议重复检测，如果检测通道仍为 40值≤45，且曲线有明显的增长曲线，判定为阳性，否则为阴性。

5.3 质控标准

阴性质控品：无特异性扩增曲线或无 Ct 值显示；

阳性质控品：扩增曲线有明显指数增长期，且 Ct 值≤32；

以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

6. 检测方法的局限性

1.样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；

2.样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；

3.阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；

4.病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；

5.不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；

6.试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；

7.本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

[注意事项]

1.所有操作严格按照说明书进行；

2.试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；

3.反应液应避光保存；

4.反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；

5.使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；

6.样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；

7.实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

8.试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

[参考文献]

[1]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局、中国国家标准化管理委员会.GB/T18638-2021 流行性乙型脑炎诊断技术[S].