白喉杆菌(CD)核酸检测试剂盒(荧光 PCR 法)

[产品名称]

商品名称：白喉杆菌(CD)核酸检测试剂盒(荧光 PCR 法)

Name ：Corynebacterium diphtheriae Detection Kit (Real-Time PCR Method)

[包装规格]25T/盒、50T/盒

[预期用途]

白喉杆菌是引起白喉的病原体，由于人群白喉杆菌带菌率很低，采集样本量很大时，常规检验方法繁琐且检出率低， 所以白喉的早期诊断与治疗对预后至关重要。目前，白喉杆菌的临床诊断主要依靠血清学检测，但是由于特异性抗体出现较晚，故无法在早期对该病进行诊断。细菌培养分离方法操作复杂和耗时，而且成功率不高。普通 PCR 法显得不敏感，加上 PCR 法的其它缺陷，使得白喉杆菌的 PCR 检测难以在临床上推广使用。实时荧光定量 PCR 是一种快速检测病原体的高特异和高敏感技术。

本试剂盒利用实时荧光定量 PCR 原理，定性检测白喉杆菌，对白喉杆菌的诊断及疗效评估有重要指导意义。

[检验原理]

本试剂盒采用 TaqMan 探针法实时荧光 PCR 技术，针对白喉杆菌高度保守区设计一对特异性引物和探针，利用相应仪器对 PCR 过程进行实时监测，实现检测结果的定性分析，用于临床上对可疑感染病料的病原学诊断。

[试剂组成]

说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用。

[储存条件及有效期]

-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次，有效期 12 个月。

[适用仪器]

ABI7500 、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。[标本采集]

适用于人体的血液、体液和棉拭子等多种样本。

[保存和运输]

采集或处理好的样品在  条件下保存应不超过 24 h；若需长期保存，应放置-70℃以下保存，冻融不超过 3 次。

[使用方法]

1. 样品处理（样本处理区）

1.1 样本前处理

血液、体液和棉拭子样本取 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中

1.2 核酸提取

推荐采用核酸提取或纯化试剂（磁珠法或离心柱法）进行核酸提取，

请按照试剂说明书进行操作。

2. 试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N（N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；反应管数每满 10 份，多配制 1 份），每测试反应体系配制如下表：

将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，20μL/管。

3. 加样（样本处理区）

将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 5μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。

4. PCR 扩增（核酸扩增区）

4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；

4.2 设置好通道、样品信息，反应体系设置为 

荧光通道选择： 检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光，请选择 NONE。

4.3 推荐循环参数设置：

5. 结果分析判定

5.1 结果分析条件设定（请参照各仪器使用说明书进行设置，以分析 ABI7500 仪器为例）

反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节 Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用户可根据实际情况自行调整，Start 值可设在 3～15、End 值可设在 5～20，使阈值线位于扩增曲线指数期，阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线），点击 Analyze 自动获得分析结果。

5.2 结果判断

阳性：检测通道 Ct 值≤40，且曲线有明显的指数增长曲线；

阴性：样本检测结果无 Ct 值，且无特异性扩增曲线；

可疑：样本检测结果 40＜Ct 值≤45，建议重复检测，如果检测通道仍为 40值≤45，且曲线有明显的增长曲线，判定为阳性，否则为阴性。

5.3 质控标准

阴性质控品：无特异性扩增曲线或无 Ct 值显示；

阳性质控品：扩增曲线有明显指数增长期，且 Ct 值≤32；

以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

6. 检测方法的局限性

1.样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；

2.样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；

3.阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；

4.病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；

5.不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；

6.试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；

7.本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

[注意事项]

1.所有操作严格按照说明书进行；

2.试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；

3.反应液应避光保存；

4.反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；

5.使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；

6.样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；

7.实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

8 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。