轮状病毒 A 组（RV-A）定量核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）
[产品名称]
商品名称：轮状病毒 A 组（RV-A）定量核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）
Name ： Rotavirus Group A Detection Kit （Real-Time PCR Method）
[包装规格]25人份/盒、50人份/盒
[预期用途]
本试剂盒适用于检测临床样品中人轮状病毒 A 组的 RNA，适用于人轮状病毒 A组感染的辅助诊断
[检验原理]
本试剂盒采用 TaqMan 探针法实时荧光 PCR 技术，设计人轮状病毒 A 组特异性引物，结合特异性探针，用荧光 PCR技术对人轮状病毒 A 组的 RNA 进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。
[试剂组成]
RV-A 阳性标准品(4.20 \times 10^{6} copies/mL)
RV-A 阳性标准品(3.45 \times 10^{5} copies/mL)
RV-A 阳性标准品(6.07 \times 10^{4} copies/mL)
RV-A 阳性标准品(4.52 \times 10^{3} copies/mL)
说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用。
[储存条件及有效期]
-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次，有效期 12 个月。
[适用仪器]
ABI7500、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。
[标本采集]
粪便标本和呕吐物标本的采集按照 SN/T1720 执行。
[保存和运输]
采集或处理好的样品在 2℃~8℃条件下保存应不超过 24h；若需长期保存，应放置-70℃以下保存，冻融不超过 3 次。
[使用方法]
1. 样品处理（样本处理区）
1.1 样本前处理
取黄豆大小约 100mg~200mg 的粪便标本或呕吐物，或 100μL~200 μL 水样便，加入 800μL 的生理盐水，剧烈振荡混匀制成 10%~20%的悬液，然后 4 ℃,8 000×g 离心 5 min，转移上清至灭菌的干净离心管。不能立即进行检测时，样本冻存于-70℃超低温冰箱备用。
1.2 核酸提取
推荐采用核酸提取或纯化试剂（磁珠法或离心柱法）进行核酸提取，请按照试剂说明书进行操作。
2. 试剂配制（试剂准备区）
根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为N（N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；反应管数每满 10 份，多配制 1 份），每测试反应体系配制如下表：
将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，20μL/管。
3. 加样（样本处理区）
将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 5μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。
4. PCR扩增（核酸扩增区）
4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR仪反应槽内；
4.2 设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL ；
荧光通道选择：检测通道（Reporter Dye）FAM、VIC， 淬灭通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光，选择None 即可。
4.3 推荐循环参数设置：
5. 结果分析判定
5.1 结果分析条件设定（请参照各仪器使用说明书进行设置，以分析 ABI7500 仪器为例）
反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节 Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用户可根据实际情况自行调整，Start 值可设在 3~15、End 值可设在 5~20，使阈值线位于扩增曲线指数期，阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线），点击 Analyze 自动获得分析结果。
5.2 质控标准
5.2.1 阴性质控品：用作阴性质控。FAM 通道无 S 型曲线，在 Reports 界面 Ct 一栏显示 Undet.；
5.2.2 阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且 Ct 值≤32；以上条件应同时满足，否则实验视为无效。
5.2.3 阳性标准品：用作标准曲线的绘制。FAM 通道有 S 型曲线，标准品线性相关系数 ${ \bf { R } } | ( | { \bf { r } } | ) { \geq } 0 . 9 8$ 。 以上条件必须在同一次实验中全部满足，否则本次实验结果无效
6. 检验结果的解释
在满足质量控制的条件下，待检样本检测结果 Ct 值为“Undet”或核酸含量显示 <1×103copies/mL ，报告“低 于试剂盒最低检测限 (1×103copies/mL), ”；核酸含量在 1×103copies/mL∼1×108copies/mL 之间的样本，直接报告测 定数值；核酸含量高于 1×108copies/mL 的样本，建议用 1×TE 稀释后重新测定，结果根据稀释倍数进行校准， 报告校准后的值，并注明“可报告浓度”。
7. 检测方法的局限性
1.样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；
2.样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；
3.阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；
4.病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；
5.不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；
6.试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；
7.本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。
[注意事项]
1.所有操作严格按照说明书进行；
2.试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；
3.反应液应避光保存；
4.反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；
5.使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；
6.样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；
7.实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；
8.试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。