线粒体呼吸链复合物I测定试剂盒/10样
测定原理:
线粒体呼吸链复合物 V,通常称为 ATP 合成酶(ATP synthase)、F 型 ATP 酶(F type ATPase)和 F1F0 ATP 酶(F1F0 ATPase),是线粒体氧化磷酸化的终极反应。其分子量为 500KD,含有十六个亚单位,其中两个:ATP酶 6 和8 为线粒体 DNA 编码的。ATP 酶主要有两个结构域:F0 为质子通道,由几个膜蛋白构成,包括 a 、 b 、c 、d 、e 、F6 、A6L 、OSCP(oligomycin sensitive conferring protein)等;和 F1 催化活性结构域,由水溶性的α3 β3 γδε蛋白构成。其最特征性的酶活性是寡霉素敏感的 ATP 合成酶。
自备仪器用品:
比色皿、培养箱、双波长分光光度仪。
实验步骤:
(一)、背景对照测定:
1、移取 780 微升缓冲液(Reagent A)到新的比色皿
2、加入 100 微升反应液(Reagent B)
3、加入 20 微升底物液(Reagent D)
4、放进 30℃培养箱里静置 3 分钟
5、加入 100 微升阴性液(Reagent C)
6、上下倾倒数次,混匀(限定在 3 秒之内)
7、即刻放进分光光度仪检测,此为背景空对照:340 波长读数 0 分钟 -340 波长读数 1 分钟或 5 分钟
(二)、样品总活性测定:
1、移取 780 微升缓冲液(Reagent A)到新的比色皿
2、加入 100 微升反应液(Reagent B)
3、加入 20 微升底物液(Reagent D)
4、放进 30℃培养箱里静置 3 分钟
5、加入 100 微升待测样品(注意:10 微克总线粒体蛋白)
6、上下倾倒数次,混匀(限定在 3 秒之内)
7、即刻放进分光光度仪检测,此为样品总活性读数:340 波长读数 0 分钟 -340 波长读数 1 分钟或 5分钟
(三)、样品非特异活性测定:
实验开始前,移取 100 微升待测样品(注意:10 微克总线粒体蛋白)到 1.5 毫升离心管,加入 20 微升专性液(Reagent E),混匀后,放进 30℃培养箱里孵育 15 分钟。然后置于冰槽里备用
1、移取 760 微升缓冲液(Reagent A)到新的比色皿
2、加入 100 微升反应液(Reagent B)
3、加入 20 微升底物液(Reagent D)
4、放进 30℃培养箱里静置 3 分钟
5、加入 120 微升上述预处理的待测样品
6、上下倾倒数次,混匀(限定在 3 秒之内)
7、即刻放进分光光度仪检测,此为样品非特异活性读数:340 波长读数 0 分钟 -340 波长读数 1 分钟或 5 分钟。
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