商品属性
产品名称 | NAD激酶（NADK）测试盒 | 产品货号 | BH-961116 |
规格 | 100管/48样、50管/24样 | 产品分类 | 辅酶Ⅱ系列 |
测试方法 | 微量法、可见分光光度法 | 用途 | 仅供科研实验 |
测定意义与原理
测定意义
NAD激酶（NADK，EC2.7.1.23）是调控细胞内NAD+与NADP+稳态的关键酶，核心功能包括：能量代谢：催化NAD+磷酸化生成NADP+，为细胞提供还原力（NADPH）氧化还原平衡：NADPH作为谷胱甘肽还原酶、硫氧还蛋白还原酶的辅酶，维持细胞抗氧化系统稳定信号转导：参与细胞内钙信号、ROS信号的调控疾病关联：NADK活性异常与癌症、神经退行性疾病、代谢综合征等疾病密切相关
测定原理
采用偶联酶法检测NADK活性，反应式如下： ATP+NAD+→NADKADP+NADP+ATP+NAD+NADKADP+NADP+ 葡萄糖-6-磷酸+NADP+→G6PDH6-磷酸葡萄糖酸+NADPH+H+葡萄糖-6-磷酸+NADP+G6PDH6-磷酸葡萄糖酸+NADPH+H+ NADPH在340nm处有特征吸收峰，通过监测吸光度上升速率计算NADK活性。
自备仪器与试剂
必备仪器
紫外分光光度计/酶标仪（340nm检测通道）
台式高速离心机（≥12000g）
恒温水浴锅（控温精度±0.5℃）
可调式移液器（0.5-10μL、10-100μL、100-1000μL）
超声破碎仪（用于细胞/细菌样本）
必备耗材
1mL石英比色皿/96孔紫外板
离心管（1.5mL、10mL）
一次性无菌吸头
研钵/组织匀浆器（冰浴专用）
自备试剂
蒸馏水/去离子水
生理盐水（0.85% NaCl）
液氮（用于样本速冻）
样本前处理方法
动植物组织样本取新鲜组织，用生理盐水冲洗干净，滤纸吸干水分称取0.1g组织，加入1mL预冷提取液，冰浴匀浆12000g 4℃离心15min，取上清液置冰上待测若酶活性过高，可用提取液稀释1-5倍后测定
血清/血浆样本血清样本：血液凝固后3000g 4℃离心10min，取血清上清血浆样本：加入抗凝剂（肝素/EDTA）后3000g 4℃离心10min，取上清样本可直接检测，无需提取处理；活性过高时可用生理盐水稀释
细胞/细菌样本收集对数生长期细胞/细菌，8000g 4℃离心5min弃上清加入1mL预冷提取液重悬，冰浴超声破碎（功率20%，超声3s/间隔10s，重复30次）12000g 4℃离心10min，取上清液置冰上待测
测定操作步骤
紫外分光光度法操作
试剂准备：
冻干粉试剂：临用前按说明书加入蒸馏水溶解
工作液A：混合NAD+溶液、ATP溶液、MgCl₂溶液，现配现用
工作液B：G6PDH酶液，用缓冲液稀释至1U/mL
预温育：
取比色皿，依次加入：提取液800μL + 工作液A100μL + 样本50μL
37℃预温育5min，记录340nm处初始吸光度A0
反应启动：
加入工作液B50μL立即混匀，开始计时
分别记录1min（A1）、2min（A2）时的吸光度值
计算ΔA：ΔA = (A2 - A1)
微量法（酶标仪）操作96孔板每孔加入：提取液80μL + 工作液A10μL + 样本5μL37℃预温育5min，加入工作液B5μL立即混匀设置动力学模式，340nm处连续读取10个循环（每1min读取1次）计算吸光度增加速率（ΔA/min）
酶活力计算方法
单位定义
U/g鲜重：每g组织鲜重每分钟生成1μmol NADPH的酶量
U/mL：每mL样本每分钟生成1μmol NADPH的酶量
U/mgprot：每mg蛋白每分钟生成1μmol NADPH的酶量
计算公式
NADK活性(U/mgprot)=ΔA×V反总×V样总ε×d×Cpr×V样测×TNADK活性(U/mgprot)=ε×d×Cpr×V样测×TΔA×V反总×V样总
ΔA：1min内吸光度变化值
V反总：反应体系总体积（1.0mL）
V样总：样本提取液总体积（mL）
ε：NADPH摩尔消光系数（6.22×10³ L/(mol·cm)）
d：比色皿光径（1cm）
Cpr：样本蛋白浓度（mg/mL）
V样测：测定时加入样本体积（0.05mL）
T：反应时间（1min）
简化公式
组织样本：NADK（U/g鲜重）= 3.22 × ΔA ÷ W
血清样本：NADK（U/mL）= 3.22 × ΔA
蛋白样本：NADK（U/mgprot）= 3.22 × ΔA ÷ Cpr
注意事项
样本处理：
样本需新鲜制备，避免酶失活；-80℃可保存1个月
匀浆与超声破碎需在冰浴中进行，控制温度在0-4℃
避免样本接触金属离子，可用EDTA螯合
试剂使用：
G6PDH酶液需现配现用，-20℃分装保存可稳定1个月
NAD+溶液对光敏感，需避光保存
不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线
测定过程：
反应温度严格控制在37℃（最适温度）
若ΔA值大于0.3，需稀释样本后重新测定
每个样本需设置3个平行孔，取平均值计算
质量控制：
每次实验设置空白对照（提取液替代样本）和阳性对照（已知活性NADK酶）
若结果偏差较大，需检查试剂是否变质、样本处理是否正确
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