果糖1,6二磷酸(FDP)测试盒
测定意义与原理
测定意义
FDP是机体内的高能代谢物和代谢调控剂，是糖酵解途径的重要中间体，广泛存在于动植物和微生物体内，能影响细胞内钾离子的浓度，改善葡萄糖和其他能量底物的代谢，促进组织氧的释放，广泛应用于临床医药制剂。其活性测定具有重要的临床和科研价值：临床诊断：诊断和监测糖尿病、心血管疾病、神经系统疾病等代谢疾病疾病监测：评估细胞能量代谢状态、组织损伤程度和治疗效果生物学研究：了解糖酵解途径、细胞凋亡和细胞增殖机制药物研发：筛选糖酵解途径抑制剂，用于治疗癌症和代谢疾病植物学研究：研究植物光合作用、碳代谢途径、抗逆性机制
测定原理
醛缩酶催化果糖1,6-二磷酸降解，产物与DNPH缩合成紫红色物质，在540nm有特征吸收峰。反应式如下： FDP→醛缩酶磷酸二羟丙酮+甘油醛-3-磷酸FDP醛缩酶磷酸二羟丙酮+甘油醛-3-磷酸 磷酸二羟丙酮+甘油醛-3-磷酸+DNPH→紫红色化合物磷酸二羟丙酮+甘油醛-3-磷酸+DNPH→紫红色化合物
试剂盒组成
紫外分光光度法/微量法试剂盒
组分 规格 作用说明
试剂一 液体60mL×1瓶 含提取液，用于提取样本中的FDP
试剂二 液体47.5mL×1瓶 含反应缓冲液，用于提供适宜的反应pH环境
试剂三 粉剂×1瓶 含底物液，反应底物
试剂四 粉剂×1瓶 含辅助底物，反应辅助因子
标准品 1mL×1支 含FDP标准液，用于建立标准曲线
ELISA法试剂盒
组分 规格 作用说明
包被板 96孔×1块 预包被抗FDP单克隆抗体
酶标抗体 液体6mL×1瓶 含HRP标记抗FDP抗体
标准品 液体1mL×6管 含0.156-10ng/mL FDP标准品
样本稀释液 10mL×1瓶 用于稀释样本和标准品
显色剂A液 6mL×1瓶 含过氧化氢溶液
显色剂B液 6mL×1瓶 含TMB溶液
终止液 6mL×1瓶 含硫酸溶液
20倍浓缩洗涤液 20mL×1瓶 用于洗涤酶标板
自备仪器与试剂
必备仪器
紫外分光光度法/微量法：紫外分光光度计/酶标仪/可见分光光度计、1mL石英比色皿/96孔板/1mL玻璃比色皿、台式离心机、恒温水浴锅、可调式移液器、研钵、电子天平
ELISA法：酶标仪、洗板机、96孔板、37℃恒温箱、可调式移液器
必备耗材
离心管（1.5mL/10mL）、一次性吸头、研钵/组织匀浆器、超声破碎仪
自备试剂：蒸馏水/去离子水、生理盐水
样本前处理方法
动植物组织样本取样：按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为1:5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）加入试剂一，冰浴匀浆离心：4℃，10000g离心10min，取上清，置冰上待测
细胞/微生物样本收集：收集500万细胞或微生物到离心管内，离心后弃上清破碎：按照细菌或细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为500~1000:1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）离心：4℃，10000g离心10min，取上清，置冰上待测
血清/血浆样本
血清(浆)样品：直接检测
测定操作步骤
紫外分光光度法/微量法操作仪器预热：分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长到540nm，蒸馏水调零试剂配制：
工作液：将试剂二全部倒入试剂一瓶中，37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）预热10分钟
试剂三稀释：500μL试剂三加500μL蒸馏水，混匀后-20℃保存备用样本测定：
试剂名称(μL) 空白管 测定管
蒸馏水/样本 100 100
工作液 800 800
试剂三 100 100
混匀后立即记录540nm处反应5min时的吸光值A1和10min时的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2
ELISA法操作试剂准备：将试剂盒从冷藏环境中取出，室温平衡15-30分钟；将20×洗涤缓冲液用蒸馏水20倍稀释后备用加样：
从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃
设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加温育：除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入HRP标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min洗涤：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）显色：每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min终止：每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值结果计算：绘制标准曲线，按曲线方程计算样本浓度
结果计算方法
单位定义
U/mg prot：每毫克组织蛋白每分钟生成1nmol紫红色化合物的酶量
U/g 鲜重：每克组织每分钟生成1nmol紫红色化合物的酶量
U/L：每升样本每分钟生成1nmol紫红色化合物的酶量
紫外分光光度法/微量法计算公式
FDP活性(U/mg prot)=(ΔA样本−ΔA空白)×V总Cpr×V样×ε×d×T×109FDP活性(U/mg prot)=Cpr×V样×ε×d×T(ΔA样本−ΔA空白)×V总×109
ΔA样本：样本管吸光度变化值
ΔA空白：空白管吸光度变化值
V总：反应体系总体积（L）
Cpr：样本蛋白浓度（mg/mL）
V样：样本体积（L）
ε：NADH摩尔消光系数（6.22×10³ L/mol/cm）
d：比色皿光径（cm）
T：反应时间（min）
ELISA法计算公式
FDP含量(ng/mL)=样本OD值−空白OD值标准品OD值−空白OD值×标准品浓度×稀释倍数FDP含量(ng/mL)=标准品OD值−空白OD值样本OD值−空白OD值×标准品浓度×稀释倍数
性能指标
指标 紫外分光光度法/微量法/ELISA法
线性范围 0~40U/L
最低检测限 ≤0.1U/L
回收率 90%~110%
批内精密度 CV≤3.2%
批间精密度 CV≤5.3%
稳定性 2-8℃保存6-12个月
注意事项
样本处理：
样本需新鲜制备，避免FDP失活；-20℃可保存3个月
组织样本需冰浴匀浆，避免酶失活
超声波破碎时需控制功率和时间，避免样本降解
试剂使用：
试剂需临用前配制，避免氧化失效
不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线
标准品需4℃保存，避免反复冻融
测定过程：
反应温度需严格控制在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）
加入样品启动反应后3秒内即刻比色测定
若吸光度值超出线性范围，需稀释样本后重新测定
质量控制：
每次实验需设置空白对照和质控样本
定期校准仪器，确保检测结果准确性
若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确
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