果糖1,6二磷酸醛缩酶(FBA)测试盒 新品

果糖1,6二磷酸醛缩酶(FBA)测试盒

测定意义与原理

测定意义

FBA（EC4.1.2.13）是糖酵解途径中的关键酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，其活性检测具有重要意义：临床诊断：诊断和监测肌肉疾病、神经系统疾病、心血管疾病等疾病监测：评估细胞能量代谢状态、组织损伤程度和治疗效果生物学研究：了解糖酵解途径、细胞凋亡和细胞增殖机制药物研发：筛选糖酵解途径抑制剂，用于治疗癌症和代谢疾病植物学研究：研究植物光合作用、碳代谢途径、抗逆性机制

测定原理

分光光度法/微量法：FBA催化果糖1,6-二磷酸生成3-磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮，在磷酸丙糖异构酶和α-磷酸甘油脱氢酶作用下催化NADH和磷酸二羟丙酮生成NAD和α-磷酸甘油，通过测定340nm处吸光度变化，计算FBA活性。反应式如下： 果糖1,6-二磷酸→FBA3-磷酸甘油醛+磷酸二羟丙酮果糖1,6-二磷酸FBA3-磷酸甘油醛+磷酸二羟丙酮 磷酸二羟丙酮+NADH+H+→磷酸丙糖异构酶/α-磷酸甘油脱氢酶α-磷酸甘油+NAD+磷酸二羟丙酮+NADH+H+磷酸丙糖异构酶/α-磷酸甘油脱氢酶α-磷酸甘油+NAD+

ELISA法：利用特异性抗体与FBA结合，通过酶标二抗检测结合的FBA，根据吸光度值计算FBA含量。

试剂盒组成

分光光度法/微量法试剂盒

组分 规格 作用说明

提取液一 50mL×1瓶 用于提取总FBA和胞浆FBA

提取液二 50mL×1瓶 用于提取叶绿体FBA

试剂一 液体25mL×1瓶 含缓冲液，用于提供适宜的反应pH环境

试剂二 粉剂×1瓶 含NADH溶液，反应底物

试剂三 粉剂×1瓶 含磷酸丙糖异构酶和α-磷酸甘油脱氢酶溶液，反应辅助因子

试剂四 液体×1瓶 含果糖1,6-二磷酸溶液，反应辅助因子

试剂五 液体×1瓶 含MgCl₂溶液，反应辅助因子

标准品 1mL×1支 含FBA标准液，用于建立标准曲线

ELISA法试剂盒

组分 规格 作用说明

包被板 96孔×1块 预包被抗FBA单克隆抗体

酶标抗体 液体6mL×1瓶 含HRP标记抗FBA抗体

标准品 液体1mL×6管 含0.1-10U/L FBA标准品

样本稀释液 10mL×1瓶 用于稀释样本和标准品

显色剂A液 6mL×1瓶 含过氧化氢溶液

显色剂B液 6mL×1瓶 含TMB溶液

终止液 6mL×1瓶 含硫酸溶液

20倍浓缩洗涤液 20mL×1瓶 用于洗涤酶标板

自备仪器与试剂

必备仪器

分光光度法/微量法：紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、恒温水浴锅、可调式移液器、1mL石英比色皿/96孔板、研钵、电子天平

ELISA法：酶标仪（450nm检测通道）、96孔板、37℃恒温箱、洗板机、可调式移液器、台式离心机

必备耗材

离心管（1.5mL/10mL）、一次性吸头、研钵/组织匀浆器、超声破碎仪

自备试剂：蒸馏水/去离子水、生理盐水

样本前处理方法

总FBA酶提取取样：建议称取约0.1g样本，加入1mL提取液一，冰浴匀浆破碎：超声破碎（冰浴，200W，破碎3s，间歇7s，总时间1min）离心：4℃，8000g离心10min，取上清测定

胞浆和叶绿体FBA酶的分离取样：按照植物组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5～10的比例（建议称取约0.1g样本，加入1mL提取液一），冰浴匀浆分离：4℃，200g离心5min，弃沉淀，取上清在4℃，8000g离心10min，取上清用于测定胞浆FBA酶活性提取叶绿体FBA：取沉淀加1mL提取液二，震荡溶解后超声破碎（冰浴，200W，破碎3s，间歇7s，总时间1min），然后4℃，8000g离心10min，取上清测定叶绿体中FBA酶活性

血清/血浆样本

血清/血浆样本可直接检测；若浓度过高，用生理盐水稀释5-10倍

测定操作步骤

分光光度法/微量法操作仪器预热：分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零试剂配制：

试剂二：临用前加5mL蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融

试剂三：临用前加5mL蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融样本测定：

试剂名称(μL) 空白管 测定管

蒸馏水/样本 100 100

试剂一 500 500

试剂二 100 100

试剂三 100 100

试剂四 100 100

试剂五 100 100

充分混匀，记录340nm处10s的吸光值A1和310s的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2

ELISA法操作试剂准备：将试剂盒从冷藏环境中取出，室温平衡15-30分钟；将20×洗涤缓冲液用蒸馏水20倍稀释后备用加样：

从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃

设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加温育：除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入HRP标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min洗涤：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）显色：每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min终止：每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值结果计算：绘制标准曲线，按曲线方程计算样本浓度

结果计算方法

单位定义

U/mg prot：每毫克组织蛋白每分钟消耗1nmol NADH的酶量

U/g 鲜重：每克组织每分钟消耗1nmol NADH的酶量

U/L：每升样本每分钟消耗1nmol NADH的酶量

分光光度法/微量法计算公式

FBA活性(U/mg prot)=321.54×ΔACprFBA活性(U/mg prot)=Cpr321.54×ΔA FBA活性(U/g 鲜重)=321.54×ΔAWFBA活性(U/g 鲜重)=W321.54×ΔA FBA活性(U/L)=321.54×ΔAV样FBA活性(U/L)=V样321.54×ΔA

ΔA：吸光度变化值

Cpr：样本蛋白浓度（mg/mL）

W：样本质量（g）

V样：样本体积（L）

ELISA法计算公式

FBA含量(U/L)=样本OD值−空白OD值标准品OD值−空白OD值×标准品浓度×稀释倍数FBA含量(U/L)=标准品OD值−空白OD值样本OD值−空白OD值×标准品浓度×稀释倍数

性能指标

指标 分光光度法/微量法 ELISA法

线性范围 0~50U/L 0.1-10U/L

最低检测限 ≤0.1U/L ≤0.05U/L

回收率 90%~110% 90%~110%

批内精密度 CV≤1.7% CV≤5.0%

批间精密度 CV≤5.0% CV≤8.0%

稳定性 2-8℃保存6-12个月 2-8℃保存6-12个月

注意事项

样本处理：

样本需新鲜制备，避免FBA失活；-20℃可保存3个月

组织样本需冰浴匀浆，避免酶失活

超声波破碎时需控制功率和时间，避免样本降解

试剂使用：

试剂二、试剂三需临用前配制，避免氧化失效

工作液需现配现用，避免试剂失效

不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线

测定过程：

反应温度需严格控制在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）

加入试剂后需充分混匀，确保反应完全

若吸光度值超出线性范围，需稀释样本后重新测定

质量控制：

每次实验需设置空白对照和质控样本

定期校准仪器，确保检测结果准确性

若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确

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