基本信息
产品名称 | Golden MLV Reverse Transcriptase（200U/ul） | 货号 | P-PR1284 |
规格 | 20KU | 用途 | 仅供科研 |
英文名称：Golden MLV Reverse Transcriptase (200U/ul)
作用机制：一种改良型的莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶，可以RNA为模板，催化合成互补DNA（cDNA），具备较高的逆转录效率和热稳定性，能有效逆转录富含二级结构的RNA模板。
适用样本：总RNA、mRNA、病毒RNA等各类RNA样本，适用于cDNA文库构建、RT-PCR、qRT-PCR等实验。
产品概述
这是在鼠源病毒反转录酶基础上改良得到的第四代反转录酶，通过定点突变去除了RNase H活性，避免反转录过程中RNA被降解。经突变文库筛选后热稳定性显著提升，可耐受55℃高温反应（最佳活性温度为50℃），相比传统42℃反转录，能更有效地打开RNA二级结构，提升复杂RNA模板的扩增性能，增加反转录cDNA的长度与产量，进而提高后续检测灵敏度。以poly(rA)为模板、oligo(dT)为引物，在37℃条件下，10分钟内催化1nmol的dTTP掺入形成酸不溶性沉淀物所需的酶量定义为一个活性单位，-20℃可保存2-3年。
产品特点
无RNase H活性：通过定点突变去除了RNase H活性，避免反转录过程中RNA被降解
热稳定性提升：经突变文库筛选后热稳定性显著提升，可耐受55℃高温反应（最佳活性温度为50℃），能更有效地打开RNA二级结构
高灵敏度：提升复杂RNA模板的扩增性能，增加反转录cDNA的长度与产量，进而提高后续检测灵敏度
活性定义明确：以poly(rA)为模板、oligo(dT)为引物，在37℃条件下，10分钟内催化1nmol的dTTP掺入形成酸不溶性沉淀物所需的酶量定义为一个活性单位
操作步骤
一、实验前准备
向漂洗液1中加入60mL无水乙醇，向漂洗液2中加入45mL无水乙醇，充分混匀后标记
载体RNA溶液配制：向300μg载体RNA冻干粉中加入300μL无酶水，充分溶解后得到1μg/μL的工作液，分装后-20℃保存
将冷冻样本置于室温解冻，轻轻颠倒混匀后备用
二、手工提取流程
样本裂解：取200μL血液样本至1.5mL离心管中，加入20μL蛋白裂解酶、300μL裂解缓冲液，振荡混匀10秒，室温孵育10分钟（每3分钟颠倒混匀1次）
磁珠结合：加入15μL磁珠悬浮液（使用前充分振荡混匀），振荡混匀10秒，室温孵育10分钟（每3分钟颠倒混匀1次）
磁珠分离：将离心管置于磁力架上，静置1-2分钟至磁珠完全吸附，小心吸弃上清液（避免触碰磁珠）
洗涤纯化：
取下离心管，加入500μL漂洗液1，振荡混匀1分钟，再次置于磁力架上分离磁珠，吸弃上清
重复上述操作1次
加入500μL漂洗液2，振荡混匀1分钟，置于磁力架上分离磁珠，吸弃上清
重复上述操作1次
干燥磁珠：保持离心管在磁力架上，室温晾干5-10分钟（确保乙醇完全挥发，避免过度干燥）
核酸洗脱：加入100-200μL洗脱缓冲液，振荡混匀后56℃孵育5分钟，置于磁力架上分离磁珠，上清液即为提取的核酸
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注意事项
实验操作需在洁净环境中进行，佩戴手套、口罩，避免样本交叉污染
蛋白酶K需-20℃保存，使用时避免反复冻融，可分装后使用
还原剂需现用现加，避免长时间暴露于空气中失效
若毛囊样本角质化严重，可适当延长孵育时间或增加还原剂用量
提取的DNA可置于-20℃长期保存，短期可在4℃储存
若需提高DNA产量，可将洗脱液重复洗脱一次吸附柱
关键字： Golden MLV Reverse T;
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